ATP liberado por osteoclastos activa la síntesis proteica del músculo esquelético a través de la vía Pl3K/Akt/mTOR

Abstract

Huesos y músculos son órganos integrados en la locomoción y el crecimiento; el compromiso de uno de ellos puede afectar la estructura y función del otro. Pérdidas o aumentos simultáneos de la masa ósea y muscular se observan en múltiples situaciones fisiopatológicas. En los últimos años, se ha desarrollado el concepto que, adicionalmente a la comunicación mecánica entre huesos y músculos, existe una comunicación bioquímica a través de moléculas solubles que actuarían de manera paracrina. Se ha demostrado que tanto las células de remodelación ósea (osteoblastos, osteoclastos y osteocitos) como las células musculares esqueléticas, tienen receptores para ATP extracelular de tipo P2X/P2Y, que regulan su diferenciación y funcionalidad. Además, se ha demostrado que tanto osteoblastos como osteocitos liberan ATP al medio extracelular tanto basalmente como por estímulos mecánicos. Se desconoce si este efecto también ocurre en osteoclastos. En los últimos años nuestro grupo ha demostrado la acción del ATP extracelular en el músculo esquelético, donde es liberado durante la actividad muscular y actúa de manera autocrina regulando la expresión de genes que controla la plasticidad muscular. Teniendo en cuenta que: 1) Existe una relación entre la masa ósea y la masa muscular, que se ve afectada por aumento y disminución de la carga mecánica; 2) El estímulo mecánico aumenta la liberación de ATP desde osteoblastos y osteocitos; 3) El músculo esquelético expresa receptores purinérgicos que regulan la expresión de genes; 4) En otros tipos celulares se ha demostrado que ATP extracelular activa la vía PI3K-Akt-mTOR, con efectos en el crecimiento, sobrevida y proliferación celular; 5) La vía PI3K-Akt-mTOR es importante en la regulación de la síntesis de proteínas en músculo esquelético, en este trabajo se puso a prueba la siguiente hipótesis: “Osteoclastos liberan ATP al medio extracelular por estímulos mecánicos y aumentan la síntesis de proteínas en músculo esquelético a través de la activación de receptores P2 asociados a la vía PI3K-Akt-mTOR”. En esta tesis demostramos que osteoclastos purificados a partir de la línea celular RAW264,7 diferenciada en presencia de RANKL, liberan ATP al medio extracelular tanto basalmente como en respuesta a estimulación mecánica por movimiento del medio. La liberación de ATP es proporcional a la intensidad del estímulo, e independiente de la lisis celular. La liberación de ATP basal ocurre tanto por vía vesicular como por vía conductiva a través de hemicanales de panexina 1. La liberación de ATP inducida por estímulo mecánico ocurre por vía conductiva, mediada por receptores P2X7. Paralelamente, demostramos que el ATP exógeno promueve la fosforilación de Akt (S473) en músculo FDB aislado de ratones adultos, de manera tiempo- y concentración-dependiente, con máximos a los 7-15 min y 3 μM de concentración. ATP 3 μM indujo fosforilación de las proteínas río debajo de Akt: mTOR (S2448), p70S6K (T389) y 4E-BP1 (T37/46). ATP 3 μM aumentó 1,41 veces la tasa de síntesis de proteínas en músculo FDB; este efecto fue bloqueado con suramina (antagonista general P2X/P2Y), LY294002 (inhibidor de fosfatidilinositol 3 quinasa) y rapamicina (inhibidor de mTOR). Finalmente, en cocultivos en cámaras Transwell®, demostramos que osteoclastos estimulados mecánicamente promueven la síntesis de proteínas en músculo FDB aislado, a través de un mecanismo dependiente de la liberación de ATP y activación de la vía P2-PI3K-Akt-mTOR en las células musculares. Considerando los resultados de este trabajo quedan varias propuestas de futuros trabajos de investigación como: 1) La liberación de ATP por los osteoclastos podría promover la liberación de otras moléculas (osteoquinas), de mayor vida media o potencia, que tengan efecto inductor de la masa muscular; 2) El ATP liberado por los osteoclastos podría ejercer un efecto autocrino modificando su función durante estimulación mecánica afectado la remodelación ósea y sincronizando esta señal con procesos de remodelación muscular. Pero, además, abren una nueva área de interés clínico en patologías óseas y musculares en las cuales se ven afectadas sus masas, en condiciones como la pérdida de masa musculoesquelética durante el envejecimiento (osteoporosis/sarcopenia), o en procesos adaptativos relacionados con el uso/desuso muscular en las cuales moléculas liberadas por ambas estructuras pudieran llegar a afectar todos estos procesos.

Bones and muscles are integrated tissues involved in locomotion and growth; the dysfunction of one of them can affect the structure and function of the other. Losses or simultaneous increases in bone and muscle mass are observed in multiple pathophysiological situations. In recent years a new concept emerges which considers that, in addition to the mechanical communication between bones and muscles, there is a biochemical crosstalk through soluble molecules acting in a paracrine manner. It has been demonstrated that bone cells (osteoblasts, osteoclasts and osteocytes) and skeletal muscle cells have P2X/P2Y receptors for extracellular ATP, which regulate their differentiation and functionality. In addition, it has been reported that both osteoblasts and osteocytes release ATP to the extracellular medium both basally and by mechanical stimulation. It is unknown if this effect also occurs in osteoclasts. In recent years, our group has demonstrated the role of extracellular ATP in skeletal muscle, where it is released during muscle activity and acts in an autocrine manner regulating gene expression that controls muscle plasticity. Taking into account that: 1) There is a relationship between bone mass and muscle mass, which is affected by increase and decrease of the mechanical loading; 2) Mechanical stimulation increases ATP release from osteoblasts and osteocytes; 3) Skeletal muscle expresses purinergic receptors that regulate gene expression; 4) In other cell types it has been shown that extracellular ATP activates the PI3K-Akt-mTOR pathway, with effects on cell growth, survival and proliferation; 5) The PI3K-Akt-mTOR pathway is relevant for regulating protein synthesis in skeletal muscle; in this work the following hypothesis was tested: "Osteoclasts release ATP to the extracellular medium by mechanical stimuli and increase protein synthesis in skeletal muscle through the activation of P2Y receptors associated with the PI3K-Akt-mTOR pathway ". In this thesis we demonstrated that osteoclasts, purified from the RAW264.7 cell line differentiated by RANKL, release ATP to the extracellular medium both basally and in response to mechanical stimulation by medium perturbation. The ATP release is proportional to the intensity of the stimulus and independent of cell lysis. The basal release of ATP occurs both via vesicular exocytosis and via conductive mechanisms through pannexin 1 hemichannels. The ATP release evoked by mechanical stimulation occurs via a conductive mechanism mediated by P2X7 receptors. In parallel, we demonstrated that exogenous ATP promotes Akt phosphorylation (S473) in FDB muscle isolated from adult mice, in a time- and concentration-dependent manner, with maximal values at 7-15 min and 3 μM. ATP also induced phosphorylation of proteins downstream Akt: mTOR (S2448), p70S6K (T389) and 4E-BP1 (T37 / 46). ATP 3 μM increased the protein synthesis rate in FDB muscle by 2.2 times; this effect was blocked with suramin (general P2X / P2Y antagonist), LY294002 (phosphatidylinositol 3 kinase inhibitor) and rapamycin (mTOR inhibitor). ATP 3 μM did not significantly modify the activity of the degradation pathway that involves ubiquitin 3 ligase-proteosome. Finally, using co-cultures in Transwell® ® chambers, we demonstrated that mechanically stimulated osteoclasts promote protein synthesis in isolated FDB muscle, through a mechanism dependent on the ATP release and activation of the P2-PI3K-Akt-mTOR pathway in muscle cells. Considering that ATP is a ubiquitous molecule, released by multiple cell types at the musculoskeletal system (muscle fibers, bone cells, blood vessel cells, connective tissue fibroblasts), it could participate in the fine regulation of muscle mass. These evidences open a new area of clinical interest in bone and muscle pathologies, in conditions such as the loss of musculoskeletal mass during aging (osteoporosis / sarcopenia), or in adaptive processes related to muscle use/disuse. In addition to its clinical relevance, knowing the processes that control the homeostasis of the musculoskeletal system is an attractive target in the field of exercise physiology and high-performance training.