Control metabólico de la regeneración hepática asociada a la realización de ligadura portal y partición de parénquima hepático (ALPPS) : activación de la vía AMPK/mTOR

Abstract

Introducción: Associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy –ALPPS- es una técnica que combina la ligadura portal con la partición del parénquima, aumentando el volumen del remanente hepático previo a la resección. Los mecanismos biológicos implicados en tal respuesta regenerativa son desconocidos, aunque podrían estar asociados a la modulación de la actividad de AMPK/mTOR. El objetivo de este estudio fue determinar los mecanismos implicados en la ganancia de masa hepática post ALPPS en un modelo experimental animal y en pacientes, incluyendo el estudio de señales metabólicas y la participación de la vía AMPK/mTOR. Materiales y métodos: Ratas Sprague Dawley (200-230 g) se asignaron a 4 grupos: modelo de ALPPS, ligadura portal (LP), partición hepática y sham. Se cuantificó la tasa de regeneración hepática, niveles séricos de marcadores de regeneración hepática, indicadores inmunohistoquímicos de proliferación hepatocelular (Ki-67) y parámetros de función hepática a 1, 3 y 7 días post cirugía. Se evaluó la expresión y activación de moléculas que participan en la vía de mTOR mediante qRT-PCR y los efectos de rapamicina, su inhibidor selectivo. A su vez, se estudió un grupo de pacientes sometidos a ALPPS referidos al Hospital del Salvador entre los años 2013 al 2015. En una primera etapa, la rama portal derecha fue ligada y el hígado transectado en el límite de los segmentos II-III; seguido de segundo tiempo resectivo. Los cambios de volumen del tejido hepático remanente (VHR) se analizaron mediante imágenes tomográficas con software OsiriX®. En ambos tiempos operatorios, se obtuvo muestras de suero, así como de tejido hepático deportalizado y del remanente, efectuándose análisis inmunohistoquímicos (Ki-67) y de expresión de la vía mTOR mediante qRT-PCR. Se analizó morbimortalidad perioperatoria y sobrevida asociada a ALPPS. Resultados: Las ratas sometidas a ALPPS presentaron una ganancia de masa del remanente hepático significativamente mayor versus controles a 24 y 72 hrs, alcanzando igual masa que el grupo LP al 7° día, lo que estuvo asociado a un aumento significativo de núcleos Ki-67 (+) (p<0,05). La función hepática se conservó en ratas ALPPS, observándose un incremento transitorio de GOT-GPT a las 24 hrs, sin diferencias respecto al grupo LP (p>0,05). Los niveles de IL-6 sérica aumentaron en ALPPS versus todos los grupos controles (p<0,05). En grupos ALPPS y LP aumentaron los niveles de mRNA de mTOR (p<0,05), siendo la respuesta regenerativa de ratas ALPPS suprimida significativamente con rapamicina (p<0,01). Se incluyeron n=11 pacientes sometidos a ALPPS, edad media 58,8 ± 8 años. El VHR aumentó un 111,6 ± 63,47% (p<0,05) en 9,1 ± 1,59 días, con un aumento de 34,43±17,27 mL/día. La tinción nuclear Ki-67 (+) fue significativamente mayor en hepatocitos del remanente hepático en la segunda etapa versus la primera (p<0.05), sin diferencias entre muestras de lóbulos deportalizados. Entre la 1° y la 2° etapas de ALPPS hubo un aumento significativo de marcadores serológicos de regeneración hepática IL-6, TNF-α, HGF y EGF (p<0,05). Los niveles de mRNA de mTOR, S6K1 y 4E-BP1 aumentaron en el remanente hepático tras ALPPS (p<0.05), mientras que los niveles de mRNA de AMPK no se modificaron significativamente (p=0.26). No hubo cambios significativos en los lóbulos deportalizados. El 100% de los casos completó el segundo tiempo resectivo, presentándose complicaciones ≥IIIB en el 36,3% (4/11) de los pacientes. No hubo mortalidad a 90 días de las intervenciones. Conclusión: ALPPS induce un aumento significativo de la masa del remanente hepático en un tiempo menor respecto a animales sometidos a ligadura portal y controles; y a técnicas clásicas de ligadura portal efectuada en pacientes, sin presentar un deterioro en la función hepática global. Este aumento en el volumen del remanente hepático tras ALPPS está asociado a un incremento de mediadores de progresión en regeneración hepática y de proliferación celular, lo que implica un incremento de masa hepatocelular funcional. Un mecanismo involucrado en esta respuesta corresponde a la activación de la vía AMPK/mTOR, que participa en la regulación de procesos celulares asociados a biosíntesis de macromoléculas y crecimiento celular.

Introduction: Associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy -ALPPS- is a technique that combines portal ligation with parenchymal partition, increasing the liver remnant volume prior to resection. The biological mechanisms involved in this regenerative response are unknown, although they could be associated with the modulation of AMPK/mTOR activity. The aim of this study was to determine the mechanisms involved in hepatic mass increase triggered by ALPPS in an in-vivo experimental model and in patients, including the study of metabolic signals and AMPK/mTOR pathway role. Materials and methods: Sprague Dawley rats (200-230 g) were assigned to 4 groups: ALPPS model, portal vein ligation (PVL), hepatic partition and sham. The liver regeneration rate, serum levels of hepatic regeneration markers, immunohistochemical indicators of hepatocellular proliferation (Ki-67) and hepatic function parameters at 1, 3 and 7 days after surgery were quantified. The expression and activation of molecules involved in the mTOR pathway was assessed by qRT-PCR and WB; and the rapamycin effects, a selective mTOR inhibitor, were analyzed. In turn, a prospective study of patients undergoing ALPPS referred to Hospital del Salvador between 2013 and 2015 was studied. In a first stage, the right portal branch was ligated and liver transected at the limit of segments II-III; followed by second resective time. The volume changes of remnant liver tissue were analyzed by CT-scan using OsiriX® software. In both operative times, serum samples were obtained, as well as of remnant and deportalized liver tissue, performing immunohistochemical analysis (Ki-67) and expression studies of mTOR pathway using qRT-PCR. It was analyzed perioperative morbidity and survival associated with ALPPS. Results: The rats submitted to ALPPS showed a significantly higher liver remnant mass increase versus controls at 24 and 72 hrs, reaching the same mass as the PVL group on the 7th day, which was associated with a significant increase in Ki-67 (+) nuclei (p<0.05). Liver function was preserved in ALPPS rats, although there was transaminases transient increase at 24 hrs, without differences compared with PVL group (p>0.05). Serum IL-6 levels increased in ALPPS versus all control groups (p<0.05). In ALPPS and PVL groups increased mTOR mRNA levels (p<0.05), and the regenerative response of ALPPS rats was significantly suppressed with rapamycin (p<0.01). 11 patients undergoing ALPPS, mean age 58.8 ± 8 years, were enrolled. Remnant liver volume increased 111.6 ± 63.47% (p<0.05) in 9.1 ± 1.59 days, equivalent to 34.43 ± 17.27 mL/day. Ki-67 nuclear staining was significantly higher in hepatocytes of remnant liver tissue at second stage versus the first (p<0.05), with no differences between samples of deportalized lobes. Between 1st and 2nd stages of ALPPS there was a significant increase in liver regeneration serum markers IL-6, TNF-α, HGF and EGF (p<0.05). The mRNA levels of mTOR, S6K1 and 4E-BP1 increased in liver remnant tissue after ALPPS (p<0.05), while AMPK mRNA levels were not significantly modified (p=0.26). There were no significant changes in deportalized lobes. All cases completed the second resective stage, and complications ≥IIIB were present at 36.3% (4/11) of patients. There was no 90-day mortality after ALPPS. Conclusion: ALPPS induces a significant increase of liver remnant mass in a shorter time compared to animals subjected to portal vein ligation and controls; and to classic techniques of portal vein ligation performed on patients, without impairs overall liver function. The remnant liver volume increment triggered by ALPPS is associated with an increase of liver regeneration and cell proliferation markers, which implies an increase in functional hepatocellular mass. A mechanism involved in this response is the activation of the AMPK/mTOR pathway, which regulates cellular processes associated with biosynthesis of macromolecules and cell growth.