Bases moleculares y estructurales de una nueva mutación causante de maturity onset diabetes of the young (tipo 2) en una paciente chilena

Abstract

Introducción. La glucoquinasa es una enzima fundamental para la regulación de la secreción de insulina en las células β-pancreáticas. Sus características cinéticas, principalmente su baja afinidad aparente y cooperatividad positiva para glucosa, permiten que su actividad enzimática actúe como un sensor de la concentración de glucosa en el páncreas. Específicamente, los parámetros cinéticos de este sensor definen el umbral de secreción de insulina inducido por glucosa. Este umbral permite la regulación de la glucosa sistémica ∼ 5 mM y es fundamental para la homeostasis de la glucosa. Se han descrito diversas mutaciones inactivantes que alteran los parámetros cinéticos de la glucoquinasa, las cuales causan un subtipo de diabetes monogénica llamada “Maturity-Onset Diabetes of the Young type 2” o MODY2 por sus siglas en inglés. Estas mutaciones inactivantes alteran el umbral de secreción de insulina inducido por glucosa, e introducen una desregulación de la homeostasis de la glucosa, lo cual explica el fenotipo clínico MODY2. Recientemente se descubrió una mutación no sinónima, no descrita, en la enzima glucoquinasa (G448A) de una paciente MODY2 chilena, y se desconoce cómo esta mutación afecta los parámetros cinéticos de la enzima. En esta memoria se propone que esta mutación altera los parámetros cinéticos de glucoquinasa, y el umbral de secreción de insulina inducida por glucosa, lo cual podría explicar la manifestación clínica de la paciente. Hipótesis: La mutación G448D encontrada en la paciente chilena afecta la homeostasis de la glucosa, generando una alteración del umbral de secreción de insulina inducido por glucosa por cambios en los parámetros cinéticos y la estabilidad de la glucoquinasa pancreática humana silvestre. Objetivo general: Determinar el efecto de la mutación G448D en los parámetros cinéticos y estructurales de la glucoquinasa pancreática humana silvestre, con el fin de estimar el efecto molecular de la mutación sobre la homeostasis de la glucosa y explicar el fenotipo encontrado en la paciente chilena. Objetivos específicos: (1) Determinar si la mutación G448D, o G448A alteran la estabilidad y estructura del estado nativo de la glucoquinasa pancreática humana silvestre; (2) Determinar si la mutación G448D o G448A alteran los parámetros cinéticos y la regulación intrínseca de la glucoquinasa pancreática humana, en función de la concentración de los sustratos glucosa y ATP con el fin de explicar el fenotipo encontrado en la paciente chilena. Materiales y métodos: para determinar el efecto de la mutación Gly448Asp sobre los parámetros cinéticos de la glucoquinasa presente en células β-pancreáticas humanas, se compararon los parámetros cinéticos de la enzima mutante y silvestre expresadas de manera recombinante en Escherichia coli. Las actividades enzimáticas de las enzimas purificadas se midieron usando un ensayo acoplado a NAD+, y los parámetros cinéticos se calcularon usando análisis de regresión no lineal. Resultados: La glucoquinasa mutante presentó una kcat de 4,6 ± 0,1 [s-1] cuyo valor es cercano al de la enzima silvestre. En contraste, la constante de afinidad aparente S0,5 para glucosa fue tres veces menor en comparación con la enzima silvestre. Adicionalmente, la enzima mutante no presentó cooperatividad positiva para glucosa (nH = 1,1) y mostró una ligera disminución de la Km para ATP (0,25 ± 0,03 mM) respecto de la proteína silvestre. Discusión: La ausencia de cooperatividad positiva para glucosa implicaría que la actividad enzimática de esta mutante es poco sensible a los cambios fisiológicos en los niveles de glucosa. El valor de la constante aparente de disociación nos permite inferir que, a niveles fisiológicos de glucosa, esta mutante podría estar saturada en la célula. Estas dos posibles consecuencias indicarían que esta glucoquinasa no poseería la capacidad de modular su actividad en respuesta a los cambios en la glicemia. Conclusión: Proponemos así que la glucoquinasa mutante Gly448Asp es una enzima disfuncional que afecta la correcta secreción de insulina en las células β-pancreáticas. Esta alteración del proceso de secreción podría contribuir al fenotipo MODY2 observado clínicamente

Introduction: Glucokinase is a key regulatory enzyme in the release of insulin from pancreatic β-cells. Its low apparent affinity and positive cooperativity for glucose modulate the increase in activity due to rises in glucose levels, therefore acting as the pancreatic glucose sensor. Specifically, the kinetic parameters of this sensor define the glucose stimulated insulin release, which allows tight regulation of glucose levels. Inactivating mutations in glucokinase cause Maturity-Onset Diabetes of the Young type 2 (MODY2), a subtype of monogenic diabetes. These inactivating mutations alter the glucose stimulated insulin release and introduce a dysregulation in the glucose homeostasis, which explains the MODY2 clinical phenotype. Recently, a novel glucokinase mutation (G448A) was discovered in a Chilean MODY2 patient and its effects on the kinetics are not known. In this work, we propose that this mutation alters the kinetics of glucokinase and the glucose stimulated insulin release, which could explain the clinical phenotype. Hypothesis: the G448D mutant found in the Chilean patient affects glucose homeostasis, by an alteration of the glucose stimulated insulin release produced by changes in the kinetic parameters and the stability of the wild type human pancreatic glucokinase. General objective: to determine the effect of the G448D mutation on the kinetic and structural parameters of the wild type human pancreatic glucokinase, to estimate the molecular consequences on the glucose homeostasis and the clinical phenotype displayed by the Chilean patient. Specific objectives: (1) to determine if the G448D or G448A mutation alter the stability and structure of the native state of wild type human pancreatic glucokinase; (2) to determine if the G448D or G448A mutation alters the kinetic parameters and the intrinsic regulation of wild type human pancreatic glucokinase, for both glucose and Mg-ATP-2 substrates to determine the phenotype found in the Chilean patient. Materials and Methods: to determine the effect of the Gly448Asp mutation on the pancreatic glucokinase, the wild type and mutant enzymes were expressed in Escherichia coli, and their kinetic parameters were compared. Enzymatic activity of the purified enzymes was measured using an NAD+-coupled assay, and kinetic parameters were calculated using non-linear regression analysis. Results: the Gly448Asp mutant presented a kcat value of 4.6 ± 0.1 [s-1], which is similar to the kcat of the wild type enzyme. It also displayed a three-fold lower value of apparent affinity constant for glucose, compared to the wild type glucokinase. The Gly448Asp mutant has no cooperativity for glucose (nH=1.1) and presents a slightly lower KM for ATP (0.25±0.03 [mM]) in comparison with the wild type enzyme. Discussion: The absence of positive cooperativity for glucose may imply that the mutant has a lower sensibility to physiological changes in glucose levels. In addition, the low apparent affinity constant value suggests that, at physiological glucose levels, this glucokinase is saturated; therefore, it may not be able to modulate its enzymatic activity in response to physiological changes in glucose levels. Conclusion: Since the changes of enzymatic activity and sensitivity are crucial elements for the correct sensor function of glucokinase and insulin secretion, we propose that this mutant Gly448Asp, is a dysfunctional enzyme that contributes to impaired insulin secretion, explaining the observed MODY2 clinical phenotype