Búsqueda de potenciales nuevos blancos de susceptibilidad a antimicrobianos mediante screening fenotípico de mutantes Salmonella Typhi zxx::EZ-Tn5 : inactivación del gen glna y su relación con el aumento de la susceptibilidad a ciprofloxacino

Abstract

Fundamentación: el tratamiento de muchas infecciones, incluidas las causadas por Salmonella enterica serovar Typhi, está comprometido por el aumento de la resistencia de los patógenos a los antimicrobianos, donde la necesidad de nuevos tratamientos es urgente. Una estrategia para combatir la crisis de la resistencia es la búsqueda de nuevos blancos para aumentar la susceptibilidad a antimicrobianos. Para esto, se puede utilizar el screening fenotípico sobre una colección de mutantes al azar de la bacteria en estudio. Desde el comienzo de la era antimicrobiana, esta metodología ha sido relevante para la búsqueda y descubrimiento de nuevas moléculas y blancos de susceptibilidad. Este estudio presenta un potencial blanco de inhibición, encontrado mediante screening fenotípico, no descrito en bacterias Gram negativo, cuya inactivación aumenta la susceptibilidad de S. Typhi a ciprofloxacino, y se describe parte del mecanismo que explica el cambio en la susceptibilidad observada. Objetivo: identificar mutantes de S. Typhi con susceptibilidad aumentada a antimicrobianos seleccionados y caracterizar cómo los genes mutados contribuyen al cambio de susceptibilidad encontrado. Métodos: se generaron mutantes de S. Typhi con el transposón EZ-Tn5. El screening a las mutantes S. Typhi STH2370 EZ-Tn5 se realizó con concentraciones subinhibitorias de los antimicrobianos seleccionados. Los cambios en la susceptibilidad se confirmaron por pruebas de difusión en agar y CIM. Los genes de las mutantes seleccionadas se secuenciaron y comprobaron usando mutagénesis sitio dirigida. Para evaluar la cantidad de proteínas y la expresión de genes se utilizó SDS-PAGE y RT-qPCR, respectivamente. Resultados: para encontrar nuevos blancos de susceptibilidad se transformó S. Typhi STH2370 con el transposón EZ-Tn5, se obtuvo una colección de 3.216 mutantes y se realizó un screening fenotípico con concentraciones subletales de ciprofloxacino, cloruro de benzalconio y cobre. Se encontró 6 genes nuevos, todos con susceptibilidad incrementada a ciprofloxacino, comparada con la cepa silvestre. Se preseleccionaron 5 mutantes para evaluar el perfil de susceptibilidad en un screening secundario con una batería de antimicrobianos de distintas familias, que arrojó tres mutantes candidatas a confirmación. La primera mutante confirmada fue la mutante glnA, cuyo gen codifica para glutamina sintetasa (GS). GS es esencial para la síntesis de glutamina en enterobacterias. La inactivación de glnA aumenta la susceptibilidad a ciprofloxacino al doble, comparado con la cepa silvestre. El perfil de proteínas de membrana externa por SDS-PAGE reveló un aumento de OmpF de 3,5 veces en la mutante nula en glnA, porina involucrada en la entrada de ciprofloxacino y ácido nalidíxico. La expresión de ompF incrementó 4,4 veces en la mutante glnA, comparada con la cepa silvestre. Para conocer la relación entre la expresión de glnA y ompF, se construyeron cepas bajo el control del promotor Ptet, inducible por tetraciclinas. La inducción de glnA disminuye la expresión de ompF, al mismo tiempo que disminuye la susceptibilidad a ciprofloxacino. A su vez, la inducción de ompF incrementa el halo de inhibición a ciprofloxacino. La expresión del sRNA MicF, un RNA antisentido que regula negativamente OmpF, fue de 0,25 veces en la mutante nula en glnA, comparada con la cepa silvestre. En la mutante glnA inducible existe una correlación directa entre la expresión de glnA y MicF. La deleción de micF incrementa la susceptibilidad a ciprofloxacino. Se midió la expresión de la porina OmpC, involucrada en el ingreso de antimicrobianos en S. Typhi, sin encontrarse diferencias. Con el propósito de evaluar cambios en la expresión del sistema de dos componentes que regula ompF, se evaluó la expresión de envZ y ompR, sin encontrarse diferencias. Luego, se determinó la expresión de genes que codifican para la bomba de expulsión AcrB-TolC y de los reguladores involucrados en resistencia marA, marR¸ ramA, sin encontrarse cambios en la mutante glnA comparada con la cepa silvestre. Estas observaciones sugieren que el eflujo de antimicrobianos no está afectado, soportando la idea de que la susceptibilidad aumentada es consecuencia de un aumento de la entrada de ciprofloxacino en la mutante glnA. Para entender los mecanismos involucrados en el cambio de OmpF se analizó el transcriptoma de la mutante glnA, encontrándose 267 genes diferencialmente expresados; entre ellos, genes del sistema de dos componentes NtrBC, codificados por los genes glnL y glnG, respectivamente. Estos genes se sobreexpresan en la mutante glnA y regularían positivamente la expresión de ompF. La deleción del gen glnG disminuye la susceptibilidad a ciprofloxacino. Conclusión: la inactivación de glnA en S. Typhi promueve la expresión de ompF que se traduce en un aumento de OmpF, facilitando la entrada de ciprofloxacino, incrementado la susceptibilidad a este antimicrobiano a través de dos posibles mecanismos

Background: the treatment of many infections, including infections caused by Salmonella enterica serovar Typhi, is compromised by the increasing resistance of pathogens to antimicrobials, where the need for new treatments is urgent. One strategy to combat the resistance crisis is the search for new targets to increase the susceptibility to antimicrobials through phenotypic screening. This methodology has been used to search and discover molecules and bacterial targets of susceptibility since the beginning of the antimicrobial’s era. This study presents a potential inhibition target, found by phenotypic screening, not described in Gram-negative bacteria, whose inactivation increases the susceptibility of S. Typhi to ciprofloxacin, and describes part of the mechanism that explains the change in susceptibility. Objective: to identify S. Typhi mutants with increased susceptibility to selected antimicrobials and characterize how mutated genes contribute to the change in susceptibility. Methods: S. Typhi mutants were generated with the EZ-Tn5 transposon and screened for susceptibility to ciprofloxacin, benzalkonium and cooper. Susceptible mutants were confirmed by agar diffusion and MIC assays. The genes carrying EZ-Tn5 transposon insertions were sequenced. Null mutants of interrupted genes, as well as inducible genetic constructs, were produced using site-directed mutagenesis, to corroborate phenotypes. SDS-PAGE and Real-time PCR were used to evaluate expression of proteins and genes, respectively. Results: to find new targets of susceptibility S. Typhi STH2370 was transformed with the EZ-Tn5 transposon, a collection of 3,216 mutants was obtained and phenotypic screening was performed with sublethal concentrations of ciprofloxacin, benzalkonium chloride and copper. 6 new genes were found, all with increased susceptibility to ciprofloxacin, compared to the wild-type strain. 5 mutants were preselected to evaluate the susceptibility profile on a secondary screening with a battery of antimicrobials from different families, which yielded three candidate mutants for confirmation. The first mutant confirmed was the glnA mutant. The glnA gene encodes for Glutamine Synthetase (GS). GS is essential for synthesis of glutamine in enterobacteria. Disk diffusion assays and minimal inhibitory concentration test indicated that inactivation of glnA increased twice the susceptibility to ciprofloxacin, compared to wild type strain. The analysis of outer membrane proteins profile by SDS-PAGE showed 3.5 times increase in OmpF in the glnA mutant, this porin is involved in the entry of ciprofloxacin and nalidixic acid. RT-qPCR analysis unveiled that expression of ompF increased 4.4 times in the glnA null mutant, compared to wild type strain. To understand the relation between expression of glnA and ompF, we constructed a strain with the glnA gene under control of the tetA promoter; which is induced in the presence of tetracyclines. The induction of glnA expression by adding chlortetracycline reduced the expression of ompF, at the same time that decreased susceptibility to ciprofloxacin. The opposite was observed in a mutant where ompF is under control of tetA promoter. In this case, chlortetracycline directly increased ompF expression, increasing susceptibility to ciprofloxacin. The expression of the MicF sRNA, an anti-sense RNA that negatively regulates OmpF, was 0.25 times in the mutant glnA, compared to the wild-type strain. In the inducible glnA mutant there is a direct correlation between the glnA expression and MicF. MicF deletion increases susceptibility to ciprofloxacin. Expression of porin ompC was also measured but not changes were observed. With the purpose of evaluating changes in the expression of two-component systems that may regulate OmpF, expression of envZ and ompR were analyzed in the glnA mutant. The results obtained showed no differences in the expression of these genes, in the glnA mutant. Next, expression of genes encoding for efflux pump systems AcrB-TolC and the regulators involved in resistance marR, marA and ramA, was evaluated showing no changes in the glnA mutant, compared to the wild type strain. These observations suggest that efflux of antibiotics is not affected; supporting the idea that increased susceptibility is consequence of increased entry of ciprofloxacin. To understand the mechanisms involved in the change of OmpF the transcriptome of glnA mutant was analyzed, finding 267 genes differentially expressed; among them genes of the NtrBC two-component system, encoded by the glnL and glnG genes, respectively. These genes are overexpressed in the glnA mutant and would positively regulate ompF. glnG deletion decreases susceptibility to ciprofloxacin. Conclusion: In line with our data we can conclude that inactivation of glnA gene increases expression of ompF at the transcriptional level, translating in increased in OmpF protein which in turns facilitate the entry of ciprofloxacin, thus increasing susceptibility to ciprofloxacin through two possible mechanisms