Rol de la lectora de m6A YTHDC2 en la síntesis de Gag de VIH-1

Abstract

Una vez integrado en un cromosoma celular, el VIH-1 genera un transcrito único de 9-kb o ARN mensajero completo (ARNmc) que es procesado por corte y empalme para generar los transcritos de 2-kb (completamente procesados) y luego los de 4-kb (parcialmente procesados). El ARNmc es, además, utilizado para la síntesis de las poliproteínas estructurales Gag y Gag-Pol. La regulación de la expresión génica a nivel del ARNm es un excelente punto de control y se sabe que los ARNm pueden sufrir varias modificaciones químicas donde la N6-metiladenosina (m6A) es la modificación química interna más abundante en los ARNm eucariontes, con un importante impacto en diversas etapas de la expresión génica que incluyen desde la regulación del corte y empalme, exportación nuclear, traducción hasta la degradación de un ARNm. Esta modificación es dinámica y reversible, y regulada por proteínas escritoras, borradoras y lectoras de m6A. Las escritoras METTL3 y METTL14 junto con WTAP actúan en conjunto para metilar las adenosinas de los ARNm. Las borradoras son las encargadas de remover específicamente la metilación m6A y corresponden a las proteínas FTO y ALKBH5. Las proteínas lectoras detectan y dan la funcionalidad a m6A, y corresponden a miembros de la familia YTH: YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3, YTHDC1 e YTHDC2. Diversos ARNm celulares poseen m6A y se ha determinado mediante análisis transcriptómicos la presencia de esta modificación en el ARNmc de VIH-1, sugiriendo una fina regulación de la expresión génica viral a través de la metilación de adenosinas en este transcrito. YTHDC2 se diferencia de las demás proteínas lectoras al poseer una actividad Helicasa de ARN dependiente de ATP y ser perteneciente a la familia de Helicasas de ARN con caja DExD/H. Estas Helicasas son conocidas por poseer dominios auxiliares N- y C- terminales pero YTHDC2 es la única Helicasa de ARN que contiene un dominio YTH y se ha visto que YTHDC2 promueve la traducción de sus ARNm blanco, que su silenciamiento disminuye la traducción global y, además, un screening a gran escala sugirió que YTHDC2 es necesaria para la síntesis de la proteína Gag de VIH-1. En este trabajo se propone que YTHDC2 es una lectora de m6A en el ARNm completo de VIH-1 que regula post-transcripcionalmente su expresión génica para favorecer su traducción y se busca caracterizar el mecanismo de regulación mediante la evaluación funcional de YTHDC2 silvestre y mutantes de sus dominios Helicasa, de unión a m6A (YTH), R3H y ANK en células transfectadas con un provirus de VIH-1, usando herramientas como el ensayo de gen reportero, Western blot, silenciamiento y microscopia confocal. En este trabajo mostramos que la sobre-expresion de YTHDC2 aumenta la síntesis de Gag, que su silenciamiento la disminuye, y que esta proteína celular es capaz de asociarse con el ARNmc. Además, observamos la importancia de los dominios Helicasa e YTH para la síntesis de Gag y de los dominios Helicasa, YTH, R3H y ANK para la asociación con el ARNmc. Los resultados obtenidos sugieren que la abundancia de YTHDC2 modula los niveles de Gag y del ARNmc de VIH-1

Once integrated into a cellular chromosome, HIV-1 generates a single 9-kb transcript or full-length HIV-1 RNA that is processed by alternative splicing to generate 2-kb transcripts (fully processed) and then those of 4-kb (partially processed). The full-length HIV-1 RNA is also used for the synthesis of the Gag and Gag-Pol structural polyproteins. Regulation of gene expression at the mRNA level is an excellent checkpoint and it is known that mRNAs can undergo several chemical modifications where N6-methyladenosine (m6A) is the most abundant internal chemical modification in eukaryotic mRNAs, with a significant impact on various stages of gene expression ranging from the regulation of splicing, nuclear export, translation to the degradation of an mRNA. This modification is dynamic and reversible and regulated by writers, erasers and readers of m6A. The writers METTL3 and METTL14 together with WTAP act to methylate the mRNA adenosines. The erasers are responsible of removing specifically the m6A methylation and correspond to the FTO and ALKBH5 proteins. The reader proteins detect and give the functionality to m6A and correspond to members of the YTH family: YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3, YTHDC1, and YTHDC2. Several cellular mRNAs possess m6A and the presence of this modification in the full-length HIV-1 RNA has been determined by transcriptomic analysis, suggesting a fine regulation of viral gene expression through adenosine methylation. YTHDC2 differs from other reader proteins as it possesses an ATP-dependent RNA helicase activity belonging to the family of DExD/H-box RNA helicases. These helicases are known to harbour N- and C-terminal auxiliary domains but YTHDC2 is the only RNA helicase that contains an YTH domain. It has been shown that YTHDC2 promotes translation of its mRNA targets and that its silencing decreases overall translation and, also, a large-scale screening suggested that YTHDC2 is necessary for the synthesis of the HIV-1 Gag protein. In this work it is proposed that YTHDC2 is an m6A reader of the full-length HIV-1 RNA that post-transcriptionally regulates viral gene expression at the level of translation and seeks to characterize the regulatory mechanism through the functional evaluation of wild type YTHDC2 and mutants of its helicase, m6A binding (YTH), R3H and ANK domains in cells transfected with an HIV-1 provirus, using tools such as reporter gene assay, Western blotting, gene silencing, and confocal microscopy. In this work, we show that the over-expression of YTHDC2 increases the synthesis of Gag, that its silencing decreases it, and that it can associate with the full-length HIV-1 RNA. Besides, we note the importance of the helicase and YTH domains for the synthesis of Gag as well as the helicase, YTH, R3H and ANK domains for the association with the HIV-1 RNA. These results obtained suggest that the abundance of YTHDC2 modulates the synthesis of Gag and the full-length HIV-1 RNA levels