Evaluación del receptor de la lipoproteína de baja densidad oxidada, Lox-1, como nuevo blanco terapéutico para fibrosis cardíaca

Abstract

Posterior a un infarto cardíaco, aparecen y se perpetúan en el corazón miofibroblastos (MFC). Estas células tienen función contráctil y secretora de matriz extracelular (MEC). La acumulación de MEC en el tejido cardíaco se denomina fibrosis y su continuidad crónica puede llegar a producir arritmias e insuficiencia cardíaca (IC), entre otras patologías. A la fecha no existe tratamiento para prevenir o atenuar este proceso cuando se torna patológico, por lo que es relevante la búsqueda de nuevos blancos farmacológicos. Antecedentes demuestran que la lipoproteína de baja densidad oxidada (LDLox) se asocia al desarrollo de fibrosis renal y hepática, pero no ha sido implicada en la fibrosis cardíaca, aunque si ha sido demostrada su acumulación en los ventrículos de personas con enfermedades coronarias. En modelos in vitro se ha observado que el tratamiento de distintos tipos celulares con las LDL oxidadas estimula tanto la proliferación como la secreción de COL-1. Además, en corazones de ratones knockout para LOX-1, el principal receptor de estas partículas, que fueron sometidos a isquemia/reperfusión (I/R) se observó baja acumulación de colágeno en comparación a lo observado en ratones wild type. Más aún, en nuestro laboratorio se determinó que el nivel de LOX-1 es mayor en MFC que en FC de rata adulta y que dichos niveles aumentan durante el proceso de diferenciación in vitro. Existen varios inhibidores descritos para el Receptor LOX-1, pero sólo están disponibles comercialmente: las procianidinas (tipo B y C) y las estatinas. Ambas podrían ser usadas para inhibir la vía LDLox/LOX-1 en MFC. Una vez que LDLox se une a su receptor LOX-1, este es internalizado vía caveolas y activa a la enzima NOX-2 con la consecuente producción de ROS. La principal proteína de las caveolas, caveolina- 1 (CAV1), es regulada positivamente por LDLox y se ha descrito como una proteína relevante en fibrosis cardíaca. Sin embargo, no se ha descrito su regulación vía LDLox/LOX-1 en MFC. En razón a los antecedentes presentados, la hipótesis de esta tesis fue: “Determinar si la vía LDLox/LOX-1 aumenta la señal fibrótica en MFC de manera dependiente de CAV1 y evaluar si el uso de inhibidores del receptor LOX-1 disminuye el efecto pro-fibrótico del LDLox in vitro”. Para desarrollarla se plantearon los siguientes objetivos específicos: (1) Establecer el efecto pro-fibrótico de LDLox; (2) Analizar si el efecto pro-fibrótico de LDLox es dependiente del receptor LOX-1; (3) Determinar si el uso de inhibidores del receptor LOX-1 (lovastatina y procianidina C1) previenen el efecto profibrótico inducido por LDLox; (4) Evaluar si el efecto pro-fibrótico de LDLox es dependiente de los niveles de CAV1. Los resultados de esta tesis evidenciaron que la LDLox activa la vía canónica del receptor (NOXs) a los 60 min y que el tratamiento con LDLox indujo aumento significativo del nivel del receptor LOX-1 (24 y 48 h). Los tratamientos a tiempos largos aumentaron significativamente los niveles de COL-I (24- 72 h), FN-EDA (72-96 h) y de la proteína CAV1 (24-48 h). La morfología los MFC tratados con LDLox (24-72 h) evidenció disminución significativa del área celular, y las fibras de α-SMA en estas células se visualizaron menos ordenadas que las de las células sin tratamiento. Funcionalmente, los MFC estimulados con la LDLox fueron menos contráctiles con aumento significativo de la secreción de colágeno y aumento de actividad de la proMMP-9 comparado con los MFC sin tratar. A su vez, la LDLox produjo aumento significativo en la proliferación. En conjunto estos resultados demuestran por primera que la LDLox sería central en el desarrollo de fibrosis cardíaca. Por otra parte, se encontró que los MFC-siLOX-1 tratados con LDLox no aumentaron los niveles de COL-I y LOX-1 como había sido previamente descrito y presentaron una contractilidad similar a las células controles. A su vez, el tratamiento con apocinina previno el aumento de COL-I en MFC tratados con LDLox por 24 h, lo que reafirmó que la vía LDLox/LOX-1/NOXs es pro-fibrótica en MFC de rata adulta. El pre-tratamiento de MFC con lovastatina y procianidinas antes del estímulo con LDLox mostró un efecto similar al observado al silenciar LOX-1. Estos resultaron confirman a LOX-1 como un blanco terapéutico en fibrosis cardíaca y los dos fármacos podrían ser aplicables en individuos con ECVs para prevenir el desarrollo de patologías como la IC y arritmias que cursan con fibrosis, proceso que es clave en ambas alteraciones. Finalmente se demostró que LDLox aumenta significativamente el nivel de CAV-1 a las 24 y 48 hrs postratamiento con LDLox. Los MFC-siCAV1 tratados con LDLox por 24 h no aumentaron los niveles de LOX-1, COL-1 a las 24 h. similar a lo observado al silenciar el receptor LOX-1. El aumento de los niveles de CAV-1 basales e inducidos por LDLox se demostró fueron dependientes del factor transcripcional FOXO-1 en MFC.En conclusión, la vía LDLox/LOX-1 es pro-fibrótica en MFC de rata adulta y este efecto es dependiente de CAV1. Los MFC tratados con LDLox aumentan su capacidad de proliferación, son menos contráctiles y más secretores lo que explicaría un posible mecanismo por el que estas células se perpetuarían en el corazón. Finalmente se demostró que LDLox aumenta significativamente el nivel de CAV-1 a las 24 y 48 hrs postratamiento con LDLox. Los MFC-siCAV1 tratados con LDLox por 24 h no aumentaron los niveles de LOX-1, COL-1 a las 24 h. similar a lo observado al silenciar el receptor LOX-1. El aumento de los niveles de CAV-1 basales e inducidos por LDLox es dependiente de factor transcripcional FOXO-1 en MFC En conclusión, la vía LDLox/LOX-1 es pro-fibrótica en MFC de rata adulta y este efecto es dependiente de CAV1. Los MFC tratados con LDLox aumentan su capacidad de proliferación, son menos contráctiles y más secretores lo que explicaría un posible mecanismo por el que estas células se perpetuarían en el corazón

After myocardial infarction, myofibroblasts appear and perpetuate in the heart. These cells are contractile and significant producers of extracellular matrix. However extracellular matrix accumulation in injured cardiac tissue (fibrosis) can lead to arrhythmias and heart failure. To date, there is no treatment to prevent or mitigate pathological cardiac fibrosis and to find novel therapeutic targets is a key point in the cardiovascular research. Although low-density oxidized lipoprotein has been associated with the development of renal and hepatic fibrosis, its role in cardiac fibrosis is less clear. However some lines of evidence have depicted that the treatment of different cell types with low-density oxidized lipoprotein stimulates both their proliferation and collagen 1 secretion. Also our group showed that the main receptor of low-density oxidized lipoprotein LOX-1 protein levels are much higher in cardiac myofibroblasts than in adult rat cardiac fibroblasts, suggesting that their levels increased during cell differentiation. In addition, cardiospecific knockout mice for LOX-1 subjected to ischemia/reperfusion (I/R) accumulates less collagen accumulation in comparison with wild type mice. Once oxLDL binds to LOX-1, this receptor is internalized via caveole in order to activate the NADPH oxidase 2 (NOX-2) and generate reactive oxygen species. The main caveole protein caveolin-1 is positively regulated by oxLDL and also plays a relevant role in the development of cardiac fibrosis. However, the regulation of caveolin-1 by oxLDL/LOX-1 has not been investigated in cardiac myofibroblasts. The present work aims to study whether the oxLDL/LOX-1 pathway increases fibrogenesis in cardiac myofibroblasts in a caveolin-1-dependent manner. To test this hypothesis, the specific objectives were set up: 1) To investigate in vitro if oxLDL stimulates fibrogenesis in cardiac myofibroblasts; 2) To determine the role of LOX-1 on the pro-fibrotic effect of oxLDL in cardiac myofibroblasts; 3) To assess the effect of LOX-1 receptor inhibitors lovastatin and procyanidin C1 prevents oxLDL-dependent profibrotic effect; 4) To evaluate whether the pro-fibrotic effect of oxLDL is dependent on CAV1 levels in cultured cardiac myofibroblasts. The results showed that oxLDL activates the canonical receptor pathway in cultured cardiac myofibroblasts, including NADPH oxidase activation and increases in LOX-1 protein level. Long-term treatment of cultured cardiac myofibroblasts with oxLDL enhances protein levels of collagen-I, fibronectin- EDA and caveolin-1. Also oxLDL stimulates the presence of dedifferentiated cardiac fibroblasts characterized by a decrease in cell area and disordered fibers containing α-smooth muscle actin. OxLDL stimulates metalloprotease-9 activity, collagen secretion and cell proliferation. Moreover, cardiac myofibroblasts knockdown for LOX-1 and treated with oxLDL did not increase the protein levels of collagen-1 and LOX-1 and exhibited a contractile phenotype similar to the controls. Interestingly, apocinin treatment prevented the ox-LDL-dependent increase of collagen-1 protein levels. Pre-treatment of these cells with lovastatin and procyanidins prior to exposure to oxLDL showed a similar effect to that seen to cardiac myofibroblasts knockdown for LOX-1. OxLDL significantly increases the level of caveolin-1 protein after 24 and 48 h in cultured cardiac myofibroblasts. The treatment of these cells with siRNAs for caveolin-1 or for LOX-1 and further exposure to oxLDL prevent increases in LOX-1 and collagen-1 protein levels. The oxLDL-dependent increase of basal levels of caveolin-1 seems to be driven by the FoxO-1 transcription factor. In summary, the activation of oxLDL/LOX-1 pathway stimulates fibrogenesis in adult rat cardiac myofibroblasts, being this effect dependent of caveolin-1. OxLDL also increases proliferation and the development of a less contractile and more secretive phenotype. In aggregate these effects of oxLDL on cardiac myofibroblasts could explain their perpetuation in the injured heart