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Caracterización de alteraciones de RNA en escherichia coli bajo estrés oxidativo y de su efecto sobre la traducción del mensaje genético

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Acceso abierto
Publication date
2020-05
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Cómo citar
Orellana Orellana, Omar
Cómo citar
Caracterización de alteraciones de RNA en escherichia coli bajo estrés oxidativo y de su efecto sobre la traducción del mensaje genético
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Author
  • Leiva Araya, Lorenzo Eugenio;
Professor Advisor
  • Orellana Orellana, Omar;
  • Katz Zondek, Assaf;
Abstract
En los últimos años, distintos grupos apoyan la tesis de una regulación traduccional bajo algunas condiciones de estrés, tanto a nivel de la iniciación como de la elongación. Sin embargo, existe controversia en algunos de los mecanismos propuestos. Una de las principales condiciones adversas a las que se enfrentan las bacterias es el estrés oxidativo. Frecuentemente las bacterias están expuestas a diversos factores ambientales y antropogénicos capaces de promover la formación de moléculas oxidantes, que en ciertas condiciones pueden inducir estrés oxidativo. En consecuencia, tales microorganismos han desarrollado mecanismos que les permiten sobrevivir en ambientes muy hostiles, como el interior de macrófagos humanos u otros animales. Por años, el estudio del control de estos mecanismos se ha centrado en los cambios transcripcionales que ocurren producto de dicha condición de estrés. Sin embargo, los componentes de RNA que participan en la traducción no son estáticos, y también responden a los cambios ocurridos en el entorno celular. En efecto, existen ejemplos de alteraciones inducidas bajo algunas condiciones de estrés, que afectan a los tres RNA centrales de la traducción: mRNA, tRNA y rRNA. Este trabajo intenta contribuir a esta discusión, determinando cambios en componentes de la maquinaria traduccional de Escherichia coli bajo estrés oxidativo, centrando el análisis en las moléculas de RNA y cómo estos cambios inciden en la traducción del mensaje genético. Nuestros análisis muestran que el estrés oxidativo inhibe el inicio canónico de la traducción de mRNA y al mismo tiempo activa el inicio traduccional de mRNA carentes de líder (lmRNA). El inicio canónico de la traducción parece ser inhibido producto de la acumulación de (p)ppGpp. Distinto a los que ha sido propuesto en la literatura, la traducción de lmRNA no dependería de la endoribonucleasa MazF. Sin embargo, ésta participaría en la generación de algunos lmRNA a través de la digestión de mRNA canónicos. Alternativamente, proponemos que la traducción de lmRNA puede ser activada producto de la generación de partículas ribosomales más pequeñas, observadas en perfiles de sedimentación. Finalmente, generamos un método que nos permitió estimar la eficiencia traduccional de cada codón durante la elongación. Esta consiste en una genoteca de variantes de GFP, que nos permitió observar la síntesis de proteínas en el tiempo, en distintas condiciones de cultivo. Haciendo uso de ésta, comparamos la eficiencia traduccional de todos los codones en medio mínimo y bajo estrés oxidativo. De este análisis observamos que bajo estrés oxidativo algunos codones (TCC, GGA, CTC, CCT y CCC) conservan o incrementan su eficiencia traduccional respecto al resto de codones, a pesar de la inhibición antes mencionada para mRNA canónicos. Basado en estos y otros resultados proponemos que la inhibición del inicio canónico de la traducción es mayor que la inhibición de la elongación.
 
In recent years, different researchers have proposed that translational regulation is central to the response to some stress conditions, during either its initiation and/or elongation steps. However, there is controversy over some of proposed mechanisms. One of the important hostile conditions confronted by bacteria is oxidative stress. Bacteria are often exposed to various environments and anthropogenic factors that favor the production of oxidative molecules, which in some conditions can produce oxidative stress. Consequently, these microorganisms have developed mechanisms to overcome this stress at diverse environments, such as inside of macrophages from humans or other animals. For many years, the study of these mechanisms has focused on transcriptional changes triggered by the stress. However, the RNA components involved in translation are not static and also respond to changes in the cellular environment. In fact, there are examples of alterations induced by oxidative stress conditions to the main three types of RNA key to translation: mRNA, tRNA, and rRNA. This work tries to contribute to that discussion, determining changes in the components of the Escherichia coli translation machinery under oxidative stress, focusing our analysis on RNA molecules and how these changes affect the translation of the genetic message. Our analyzes show that oxidative stress inhibit initiation of translation from canonical mRNA and, at the same time, activates translation initiation from leaderless mRNA (lmRNA). Canonical translation seems to be inhibited by the accumulation of (p) ppGpp. Contrary to what other have been proposed, translation of lmRNA does not depend on MazF endoribonuclease, which may, nevertheless, promote the generation of some of the lmRNA through digestion of canonical mRNA. As an alternative mechanism, we propose that translation of lmRNA may be activated by the production of lighter ribosomal particles which we have observed on sedimentation profiles. Finally, we used a library of GFP variants to estimate the efficiency of translation for each codon during elongation. This allows us to study protein synthesis over time, comparing the efficiency of translation of all codons between minimal media and oxidative stress conditions. From this analysis we observe that under oxidative stress, some codons (TCC, GGA, CTC, CCT and CCC) maintain or increase their efficiency of translation, despite the general inhibition of the canonical mRNAs mentioned above. Based on these and other results we propose that inhibition of canonical translation initiation is stronger than inhibition of elongation.
 
General note
Tesis para optar al grado de Doctor en Ciencias mención Microbiología
Identifier
URI: https://repositorio.uchile.cl/handle/2250/176849
Collections
  • Tesis Postgrado
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