Mecanismo y evolución de la activación por AMP en quinasas de azúcares dependientes de ADP de Archaea

Abstract

Las enzimas que fosforilan glucosa y fructosa-6-fosfato (F6P) en la glicólisis de la mayoría de los organismos del phylum Euryarchaeota de Archaea utilizan ADP en lugar de ATP como dador de fosforilo. Estas enzimas están emparentadas filogenéticamente y pertenecen a la Superfamilia Riboquinasa y han sido descritas como no reguladas alostéricamente. Sin embargo, recientemente se ha descrito que la enzima bifuncional de Methanococcus maripaludis, perteneciente al orden de los Methanococcales, es activada por AMP, rasgo que estaría ausente en las enzimas PFK y GK de Thermococcales, que son específicas por glucosa o por F6P. A partir de este hallazgo surgen dos interrogantes. Por un lado, acerca del mecanismo mediante el cual esta activación ocurre. Por otro lado, acerca de si se trata de un rasgo ancestral o de una novedad evolutiva. Ambas cuestiones fueron abordadas experimentalmente. Para esto, el trabajo de tesis se dividió en dos partes. Por un lado, se estudió el mecanismo de activación por AMP usando como ejemplar la enzima bifuncional de Methanococcus maripaludis (MmPFK/GK). Para realizar una caracterización fisicoquímica de esta activación se realizaron estudios de cinética enzimática en estado estacionario. Previo a la caracterización de la activación por AMP se procedió a determinar el mecanismo cinético de la enzima. Esto se hizo para distintas concentraciones de AMP para ambas actividades enzimáticas. Se obtuvo que la enzima posee un mecanismo secuencial ordenado para ambas actividades, donde MgADP es el

primer sustrato en unirse a la enzima y AMP el último producto en disociarse. Además, en ambas actividades existe inhibición por el sustrato azúcar, la que ocurre mediante la formación de dos complejos de punto muerto E-Azúcar y E-AMP-Azúcar. Sin embargo, en la actividad PFK el posible AMP alostérico produce que el segundo complejo deje de formarse. La activación por AMP ocurre principalmente mediante un aumento en la afinidad por el sustrato azúcar, efecto que es mayor en la actividad GK que en PFK. En ambas actividades esto además causa un aumento en el efecto inhibitorio del azúcar debido a que también aumenta la afinidad por azúcar en especies no productivas catalíticamente, como la enzima libre y el complejo E-AMP. Estas conclusiones fueron reforzadas mediante estudios de unión de ligando realizados mediante ensayos de fluorescencia intrínseca, además de experimentos de modificación química utilizando un análogo de AMP fotoactivable. La segunda parte de este trabajo consistió caracterizar evolutivamente la activación por AMP. Para ello se realizó un estudio cinético comparativo entre distintas enzimas actuales de esta familia, cada una representando diversas ramas tales como PFKs específicas de Thermococcales, GKs específicas de Thermococcales y bifuncionales de Methanococcales y Methanosarcinales. Además, para caracterizar la ruta evolutiva de la aparición o conservación de la activación por AMP, se analizó la presencia de este rasgo en diversas proteínas ancestrales inferidas en esta familia de enzimas. Se obtuvo que la activación por AMP es un rasgo ancestral que se correlaciona evolutivamente con la bifuncionalidad, pero que desapareció en conjunto con la especificación de estas enzimas por la actividad GK o PFK. Este trabajo corresponde a la primera caracterización cinética en detalle de una enzima bifuncional PFK/GK dependiente de ADP. Además, consiste en la primera caracterización a nivel mecanísitico y evolutivo de un rasgo regulatorio conservado propio de esta familia de proteínas de Archaea.

The enzymes that phosphorylate glucose and F6P in Archaeal glycolysis use ADP instead of F6P as phosphoryl donor. These enzymes are phylogenetically related and belong to the Ribokinase Superfamily. They have been described as non-regulated allosterically. However, it has recently been described that the bifunctional enzyme of Methanococcus maripaludis, belonging to the order of the Methanococcales, is activated by AMP, a trait that seems to be absent in the PFK and GK enzymes from Thermococcales, which are specific for glucose or F6P. Two questions arise from this finding. On the one hand, about the mechanism by which this activation occurs. On the other hand, about whether it is an ancestral trait or an evolutionary novelty. Both questions were experimentally addressed. For this reason, the thesis was divided into two parts. On the one hand, the mechanism of activation by AMP was addressed by using the bifunctional enzyme from Methanococcus maripaludis (MmPFK / GK) as an exemplar. In order to perform a physicochemical characterization of this activation, steady state kinetic studies were performed. Prior to the characterization of AMP activation, the kinetic mechanism of the enzyme was determined. This was done at different concentrations of AMP for both enzymatic activities. The enzyme was found to have an ordered sequential mechanism for both activities, where MgADP is the first substrate to bind to the enzyme and AMP the last product to dissociate. In addition, in both activities there is inhibition by the sugar substrate, which occurs through the

formation of two dead-end complexes, E-Sugar and E-AMP-Sugar. However, in PFK activity AMP causes the second complex to stop forming. The activation by AMP occurs mainly through an increase in sugar substrate affinity, this effect is greater in GK activity than in PFK. In both activities this also causes an increase in the inhibitory effect of the sugar due to an increases of sugar affinity in non-productive species, such as the free enzyme and the E-AMP complex. These conclusions were reinforced by ligand binding studies performed using intrinsic fluorescence. Also, chemical modification experiments using a photoexitable AMP analog were performed for that purpose. The second part of this work consisted in the evolutionarily characterization of the activation by AMP. This was done by a comparative kinetic study between different current enzymes of this family, each representing different evolutive branches such as PFKs from Thermococcales, GKs from Thermococcales and bifunctionals from Methanococcales and Methanosarcinales. Furthermore, in order to characterize the evolutionary route of the appearance or the maitenance of AMP activation, the presence of this trait was analyzed in various reconstructed common ancestors of this family of enzymes. Activation by AMP was found to be an ancestral trait that is evolutionarily correlated with bifunctionality but disappeared in conjunction with the specification of these enzymes by GK or PFK activity. This job is the first time a bifunctional PFK/GK ADP-dependent enzyme gets kinetically characterized in detail. Moreover, is the first time that a regulatory propertye,

only present in this family of enzymes gets chgaracterized at mechanistic and evolutive level.