Estudio exploratorio de la destinación intracelular de las hemocianinas de moluscos a compartimentos endosomales en células presentadoras de antígeno murinas

Abstract

Las hemocianinas de moluscos son ampliamente conocidas por sus efectos inmunomoduladores y, además, por ser utilizadas como carrier/adyuvante de antígenos tumorales. Sus efectos sobre el sistema inmune han sido atribuidos a su gran tamaño, xenogenicidad y estructura compleja rica en azúcares, siendo esta última característica donde se han enfocado los estudios de nuestro laboratorio. Se ha establecido que la incorporación de las hemocianinas a las células presentadoras de antígenos (APCs) ocurre por macropinocitosis y endocitosis mediada por receptores, participando el receptor de manosa (MR) y el receptor de tipo Toll 4 (TLR4), entre otros. No obstante, es poco conocida la destinación intracelular de las hemocianinas y como ocurre su procesamiento y presentación antigénica. El objetivo de esta memoria ha sido caracterizar la línea celular de macrófagos murinos J774.2 y determinar si es adecuada para estudiar la destinación intracelular de las hemocianinas incorporadas por endocitosis en las APCs. Es de especial interés a futuro, establecer si estas glicoproteínas, como antígenos exógenos, pueden ser destinadas a compartimentos endosomales tempranos (Rab5+) para ser presentadas en moléculas del complejo de histocompatibilidad de clase I (MHC-I) mediante presentación cruzada, además de ser incorporadas en endosomas tardíos (Rab7+) para su presentación por la vía canónica en MHC-II. En este contexto, la hipótesis es: “Las hemocianinas al ser endocitadas por las células J774.2 inducen la secreción de citoquinas proinflamatorias como IL-6 e IL-12p40 y también, la expresión al alza de moléculas coestimulatorias como CD86 y CD80 y los antígenos MHC-I y MHC-II. En este contexto, se evaluó en la línea de macrófagos J774.2, el efecto funcional sobre algunos parámetros de la respuesta inmunológica de tres hemocianinas modelo, a saber: KLH de Megathura crenulata, FLH de Fissurella latimarginata y CCH de Concholepas concholepas. El efecto inmunológico de dichas hemocianinas se evaluó mediante su capacidad de inducir la secreción de algunas citoquinas proinflamatorias como IL-6 e IL-12p40, evaluadas mediante ELISA y también, la expresión al alza de moléculas coestimuladoras como CD80, CD86 y los antígenos de histocompatibilidad MHC-I y MHC-II. Los resultados mostraron que la línea celular de macrófagos J774.2 no es el modelo más adecuado para evaluar el efecto inmunomodulador de las hemocianinas, por cuanto se observó un aumento de la secreción de IL-6 y un incremento en la expresión de las moléculas coestimulatorias CD80 y CD86. Sin embargo, en las condiciones analizadas no se encontró un aumento en la expresión de MHC-I y MHC-II, aspecto clave este último para establecer una apropiada sinapsis inmunológica con linfocitos T

Hemocyanins from mollusks are widely known for their immunomodulatory effects, as well as being used as carrier/adjuvants for tumor antigens. Their effects have been attributed to their large size, xenogenicity, and carbohydrate-rich complex structure. It is on this last characteristic where the studies of our laboratory have focused. It has been established that the incorporation of hemocyanins into antigen-presenting cells (APCs) occurs by macropinocytosis and receptor-mediated endocytosis, involving the mannose receptor (MR) and the Toll like receptor 4 (TLR4). However, the intracellular destination of hemocyanins and their antigenic presentation process are poorly understood. The objective of this study has been to characterize the murine macrophage cell line J774.2, and to determine if it is a suitable model to study the intracellular destination of hemocyanins incorporated by endocytosis. It is of special interest in the future, to establish whether these glycoproteins, as exogenous antigens, can be destined to early endosomal compartments (Rab5+) to be presented in molecules of the class I histocompatibility complex (MHC-I) by cross presentation, in addition to being incorporated into late endosomes (Rab7+) for canonical presentation in MHC-II. In this context, the hypothesis is: “Hemocyanins, when endocyted by J774.2 cells, induce the secretion of pro-inflammatory cytokines such as IL-6 and IL-12p40 and also increase the expression of costimulatory molecules such as CD86 and CD80 and the MHC-I and MHC-II antigens”. In this context, the functional effect on some parameters of the immune response of three model hemocyanins was evaluated in the J774.2 macrophage cell line, namely: KLH from Megathura crenulata, FLH from Fissurella latimarginata and CCH from Concholepas concholepas. The immunological effect of these hemocyanins was evaluated through their ability to induce the secretion of some pro-inflammatory cytokines such as IL-6 and IL-12p40, evaluated by ELISA and the upward expression of costimulatory molecules such as CD80, CD86 and histocompatibility antigens MHC-I and MHC-II. The results showed that the J774.2 macrophage cell line is not the most suitable model to evaluate the immunomodulatory effect of hemocyanins, since an increase in IL-6 secretion and CD80 and CD86 expression were observed. However, under the conditions analyzed, there was no increase in the expression of MHC-I and MHC-II, which are essential for establishing an appropriate immunological synapse with T lymphocytes