Identificación de macrófagos M1 y M2 en aorta de ratas espontáneamente hipertensas (SHR) mediante citometría de flujo

Abstract

Antecedentes. Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte en el mundo y en nuestro país. El principal factor de riesgo es la hipertensión arterial (HTA). En Chile, el 26,9% de la población es hipertensa. La presión arterial está regulada por estímulos mecánicos y humorales y el desbalance de éstos, aumentan el flujo sanguíneo y la vasoconstricción provocando un proceso de remodelado (daño) en los vasos sanguíneos. La inflamación es una respuesta defensiva natural frente a un daño. Sin embargo, en condiciones de inflamación crónica, tal como en la HTA, se ha descrito un aumento de citoquinas proinflamatorias y macrófagos en diferentes tejidos. Existen dos subpoblaciones de macrófagos, los M1 o proinflamatorios y los M2 o antiinflamatorios. Las ratas espontáneamente hipertensas (SHR) son un modelo animal apropiado ya que reproduce de buena forma la hipertensión esencial de humanos. A la fecha no se ha estudiado la participación de macrófagos M1 y M2 en este modelo. En los últimos años la citometría de flujo (CF) ha surgido como una técnica específica, resolutiva y rápida para la identificación de macrófagos y sus subpoblaciones. Sin embargo, no existen metodologías que permitan aislar e identificar macrófagos M1 y M2 en aorta de ratas normo e hipertensas. Hipótesis. En esta tesis se propuso la siguiente hipótesis: "La citometría de flujo detecta y discrimina diferencias en los niveles de macrófagos M1 y M2 en aortas de ratas hipertensas respecto a ratas normotensas" Objetivos específicos: 1.- Diseñar e implementar una nueva metodología que permita: a) aislar macrófagos de aorta de ratas y b) detectar y discriminar las subpoblaciones M1 y M2 en aorta por citometría de flujo. 2. Evaluar los niveles de macrófagos M1 y M2 en aorta de ratas controles normotensas (WKY) y de ratas espontáneamente hipertensas (SHR), utilizando la nueva metodología implementada en el objetivo 1. Metodología. Se utilizaron ratas normotensas WKY y ratas espontáneamente hipertensas (SHR) de 4 a 5 meses, obtenidas del Bioterio de la Facultad de Medicina, Pontificia Universidad Católica de Chile (PUC), previa aprobación del Comité de Bioética Institucional. Para realizar el objetivo 1, se combinaron las metodologías de tres estudios previos de identificación de macrófagos, dos en aorta de ratón y uno de riñón de rata. Se ensayaron diferentes tiempos de digestión enzimática (30 y 60 minutos) de la aorta. Se evaluó la viabilidad celular por tinción con azul de Tripán y Ioduro de Propidio. Se seleccionaron los anticuerpos específicos marcados con el fluoróforo adecuado para la identificación específica de los macrófagos M1 y M2 y se estandarizaron las condiciones experimentales para su uso en CF. Una vez implementado el nuevo protocolo, se procedió a evaluar los niveles de macrófagos M1 y M2 en el grupo experimental normotenso (WKY, n = 9) y en el grupo hipertenso (SHR, n = 9). Resultados. Se obtuvo una viabilidad celular de leucocitos mayor al 94%. El tiempo de digestión óptimo fue 30 minutos, manteniendo los niveles de expresión de los antígenos específicos de superficie. Conclusiones. En este trabajo, por primera vez se logró diseñar e implementar una nueva metodología para evaluar macrófagos M1 y M2 en aorta de ratas. Mediante esta metodología se estableció que los macrófagos proinflamatorios o M1 están significativamente elevados en condición de HTA (14,6 ± 1,2)% respecto a una condición normotensa (9,7 ± 1,3)%. Estos hallazgos apuntan a que en una condición de inflamación crónica como la HTA, los macrófagos podrían participar en la perpetuación del daño tisular en la aorta

Background. Cardiovascular diseases are the main cause of death worldwide and particularly in our country. The main risk factor is arterial hypertension (HT). In Chile, 26.9% of the population is hypertensive. Blood pressure is regulated by mechanical and humoral stimuli and their imbalance increase blood flow and vasoconstriction, causing a remodeling process (damage) in the blood vessels. Inflammation is a natural defensive response to injury. Under conditions of chronic inflammation, such as in HT, an increase of proinflammatory cytokines and macrophages in different tissues has been described. There are two subpopulations of macrophages, the M1 or pro-inflammatory type and the M2 or anti-inflammatory type. Spontaneously hypertensive rats (SHR) are an excellent animal model since they reproduce essential hypertension caused in humans. To date, the participation of M1 and M2 macrophages has not been studied in this model. Recently, flow cytometry (CF) has emerged as a specific, decisive and rapid technique for identification of macrophages and their subpopulations. However, there are no methodologies to isolate and identify M1 and M2 macrophages in aorta of normotensive and hypertensive rats. Hypothesis. In this thesis the following hypothesis was proposed: "Flow cytometry detects and discriminates differences in levels of M1 and M2 macrophages in aortas of hypertensive rats with respect to normotensive rats". Specific objectives: 1. To design and implement a new methodology that allows: a) isolation of macrophages from rat aorta and b) to detect and discriminate the M1 and M2 subpopulations in aorta by flow cytometry. 2. To evaluate the levels of M1 and M2 macrophages in aorta of normotensive control rats (WKY) and spontaneously hypertensive rats (SHR), using the new methodology implemented in objective 1. Methodology. Normotensive WKY rats and spontaneously hypertensive rats (SHR) (4-5 months of age) obtained from the Bioterium of the Faculty of Medicine, Pontificia Universidad Católica de Chile (PUC) were used with prior approval of the Institutional Bioethics Committee. To achieve objective 1, the methodologies of three previous macrophage identification studies were combined, two performed in mouse aorta and one performed in rat kidney. Different times of digestion (30 and 60 minutes) of the aorta were tested. Cell viability was evaluated by Trypan blue and Propidium Iodide staining. Specific antibodies labeled with the appropriate fluorophore were selected for identification of M1 and M2 macrophages and the experimental conditions for their use in FC were standardized. Once the new protocol was implemented, the levels of M1 and M2 macrophages were evaluated in the normotensive experimental group (WKY, n = 9) and in the hypertensive group (SHR, n = 9). Results. Cell viability of leukocytes of over 94% was obtained. Optimal enzymatic digestion time was 30 minutes, maintaining expression levels of the specific surface antigens. Conclusions. In this work, for the first time a methodology to evaluate M1 and M2 macrophages in rat aorta was designed and implemented. Pro-inflammatory or M1 macrophages were found to be significantly increased in HTA condition (14,6 ± 1,2) compared to a normotensive condition (9,7 ± 1,3) using this methodology. These findings suggest that in a chronic inflammatory condition such as HTA, macrophages participate in the perpetuation of tissue damage in the aorta