Expresión de la proteína de la cápside del circovirus porcino en el virus de mosaico del tabaco

Abstract

El circovirus porcino de tipo 2 (PCV2), es uno de los principales agentes de pérdidas económicas en la industria porcina, pues ataca a lechones generando una serie de afecciones conocidas como enfermedades asociadas al circovirus porcino (PCVAD) y al síndrome de desmedro multisistémico post-destete, llegando a alcanzar en los casos más críticos una mortalidad de hasta 80%. Este virus posee 11 marcos de lectura, siendo ORF1 y ORF2 los más importantes. El gen orf2, de 702 pares de bases, codifica para la proteína de la cápside (CP), cuyo tamaño es de 234 aminoácidos y 27,8 kDa y corresponde a la parte más inmunogénica de PCV2. Debido a esto, y a la falta de herramientas terapéuticas para combatir las enfermedades asociadas, es que la vacunación resulta ser la alternativa más aceptada para su control, utilizando como antígeno la proteína de la cápside Orf2. Dentro de las técnicas de producción de vacunas, la utilización de vectores virales de plantas para la producción de proteínas de interés productivo ha tomado fuerza, pues resulta ser un proceso eficiente, escalable y de bajo costo. La magnifección es una técnica que utiliza vectores virales de plantas para transformar especies vegetales de manera transiente, por medio de Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens) y el proceso de agroinfiltración. En el presente proyecto de investigación se planteó la expresión de la proteína Orf2 de circovirus porcino, fusionada a las subunidades CP de la cápside del virus de mosaico del tabaco (TMV), obtenidas por medio de la técnica de magnifección en hojas de Nicotiana benthamiana (N. benthamiana). Para esto se utilizó el plasmidio pTRBO-CP154, el cual posee la secuencia codificante para la cápside de TMV, truncada en el aminoácido 154, y seguido por el sitio de clonamiento donde se insertó la secuencia de interés orf2. A partir de dicho vector se construyó el plasmidio pTRBO-CP154:orf2, con el cual fue transformada N. benthamiana. Posteriormente, se cortaron las hojas y a partir de ellas se realizó extracción de RNA y de proteínas. Si bien, el RNA obtenido fue analizado, encontrando expresión del gen de interés, no fue posible obtener un resultado favorable, pues no se pudo observar por tinción de plata, tinción por azul de Coomassie o western blot, la presencia de la proteína deseada. Por lo que se concluye que los genes de orf2 y cp se están expresando, pero la proteína fusionada no se logra expresar o purificar.

Porcine circovirus type 2 (PCV2) is one of the main agents of economic losses in the swine industry, as it attacks piglets generating a series of conditions known as porcine circovirus associated diseases (PCVAD) and is associated with post-weaning multisystemic wasting syndrome, reaching a mortality rate of up to 80% in the most critical cases. This virus has 11 reading frames, with ORF1 and ORF2 being the most important. The orf2 gene, of 702 base pairs, codes for the capsid protein (CP), whose size is 234 amino acids and 27.8 kDa and corresponds to the most immunogenic part of PCV2. Due to this, and the lack of therapeutic tools to combat associated diseases, vaccination turns out to be the most accepted alternative for its control, using the Orf2 capsid protein as antigen. Within vaccine production techniques, the use of plant viral vectors for the production of proteins of productive interest has gained strength, as it turns out to be an efficient, scalable and low-cost process. Magnifection is a technique that uses plant viral vectors to transform plant species transiently, by means of Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens) and the agroinfiltration process. In this research project the expression of the porcine circovirus Orf2 protein was proposed, fused to the CP subunits of the capsid of the tobacco mosaic virus (TMV), obtained by means of the magnifection technique in Nicotiana benthamiana leaves (N. benthamiana). For this, the plasmid pTRBO-CP154 was used, which has the coding sequence for the TMV capsid, truncated at amino acid 154, and followed by the cloning site where the sequence of interest orf2 was inserted. From that vector the plasmid pTRBO-CP154: orf2 was constructed, with which N. benthamiana was transformed. Subsequently, the leaves were cut and RNA and protein extraction was carried out from them. Although the RNA obtained was analyzed, finding expression of the gene of interest, it was not possible to obtain a favorable result, since the presence of the protein of interest could not be observed by silver staining, Coomassie blue staining or western blot. Therefore, it is concluded that the orf2 and cp genes are being expressed, but the fused protein cannot be expressed or purified.