Estudio de redes moleculares asociadas a tolerancia en células dendríticas de pacientes con artritis reumatoide y de su expresión en respuestas a moduladores inflamatorios

Abstract

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune que afecta las articulaciones y se caracteriza por una pérdida de los mecanismos de tolerancia, lo que lleva a la activación de una respuesta inflamatoria crónica frente a péptidos propios modificados en el sinovio de los pacientes, derivando en la destrucción del cartílago y hueso articular. Debido a su función inmunomoduladora, las células dendríticas (DCs) tienen un rol dual importante en la AR, en donde DCs maduras y activadas presentes en el sinovio del paciente participan en el establecimiento y propagación de esta enfermedad a través de la presentación de antígenos propios a células T auto-reactivas bajo un contexto inflamatorio; al mismo tiempo que DCs inmaduras o semi-maduras, serían capaces de interferir respuestas inflamatorias a través de la expresión de receptores inhibitorios y la producción de citoquinas anti-inflamatorias, entre otros procesos. Gracias a esta acción tolerogénica, las DCs constituyen una herramienta inmunoreguladora promisoria. Sin embargo, a pesar de que los mecanismos celulares generales por los que estas DCs tolerogénicas (tolDCs) ejercen su función reguladora se conocen, los mecanismos moleculares subyacentes a la diferenciación y función de estas células hacia el perfil inductor de tolerancia no están completamente dilucidados. Este trabajo buscó identificar genes asociados a una función reguladora en DCs derivadas de monocitos, determinar su relevancia en el establecimiento del perfil tolerogénico y evaluar si el fenotipo maduro y activado que se observa en las DCs inflamatorias de pacientes con AR obedece a que genes con función reguladora no se expresan en estas células. Para esto, se realizó un análisis transcriptómico de DCs derivadas de monocitos de pacientes con AR y de sujetos sanos, generadas usando un protocolo de inducción de tolerancia con dexametasona (Dex) y monofosforíl lípido A (MPLA) como agente activador de estas células, llamadas DM-DCs. A partir de este análisis pudimos confirmar que no existen diferencias significativas en el perfil de DM-DCs de controles sanos y pacientes AR, revelando que el protocolo de inducción de tolerancia con Dex y MPLA es capaz de remover el efecto de la enfermedad sobre el perfil fenotípico y transcripcional de las DCs de pacientes con AR, que se observó en DCs sin ningún tratamiento. Las DM-DCs tienen un perfil transcripcional particular, en donde se observaron grupos de genes cuya expresión es regulada sólo por MPLA o por Dex, pero también se encontró un grupo de genes de respuesta al estímulo con ambos agentes, de entre los cuales se encontraron varios genes potencialmente involucrados en su diferenciación y función reguladora, como MT1, CTRP1, DCR3, FPR1 y ZIP8; incluidos algunos factores de transcripción como MYC, PLZF y STAT3. La expresión diferencial de 30 genes de interés en las DM-DCs se confirmó a través de PCR en tiempo real, y en 20 de ellos se confirmó también su expresión proteica por citometría de flujo. El potencial de MYC como regulador transcripcional de genes de tolerancia de las DM-DCs se comprobó a través de ensayos de inhibición, avalando su participación en la función tolerogénica de las DM-DCs. Análisis de enriquecimiento funcional mostraron que la quimiotaxis celular, señalización célula-célula, y el metabolismo de radicales libres de oxígeno y homeostasis de Zinc, fueron las principales funciones biológicas representadas en los genes expresados diferencialmente (DE) en DM-DCs, donde la producción de ROS y homeostasis de Zinc, parecen tener un rol predominante en la biología de estas células; dado que se confirmó una mayor expresión de ROS y concentración de Zinc intracelular en las DM-DCs, en comparación con DCs maduradas con MPLA y aquellas que no recibieron tratamiento alguno. Finalmente, en la segunda parte de este proyecto, enfocada a evaluar la expresión de los genes de tolerancia identificados previamente, en DCs inflamatorias de muestras sinoviales de pacientes con AR (InfDCs), se confirmó que la expresión de los genes inmunoreguladores JAG1, MERTK e IDO1, sobre-expresados en las DM-DCs, se encuentra reprimida en las InfDCs. Estas InfDCs mostraron un aumento en genes de maduración y co-estimulación, similar a lo que se observó al diferenciar DCs a partir de monocitos de pacientes en presencia de fluido sinovial, o TNF. Nuestros resultados permiten concluir que las DM-DCs exhiben un perfil transcripcional y fenotípico distintivo, que las diferencia de DCs maduras y DCs sin estímulo, producto de la sobre-expresión de genes que median la diferenciación y función de las DCs hacia un perfil inmunoregulador.

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that affects the joints and is characterized by loss of tolerance mechanisms of the immune system, which leads to the activation of a chronic inflammatory immune response against modified self-peptides from the synovium of RA patients, eventually ending with bone erosion and cartilage breakdown. Due to their immune modulatory function, dendritic cells (DCs) play a dual role in RA, where DCs in their mature and activated state participate in the initiation and perpetuation of the inflammatory response in RA, while immature or semi-mature DCs interfere with inflammatory responses promoting immune tolerance. Is due to this tolerogenic potential, that DCs constitute a promising therapeutic tool for immune regulation. However, although the cellular mechanisms by which these tolerogenic DCs (tolDCs) exert their regulatory function are well known, the molecular mechanisms driving the differentiation and function of these cells are still poorly understood. The aim of this work was to identify genes associated with a tolerogenic function in monocyte-derived DCs, to determine their relevance in the establishment of a tolerogenic profile and determine whether the mature inflammatory profile of synovial DCs is due to the repression of tolerance-related genes under thus condition. To assess this, we developed a whole genome transcriptomic analysis of monocyte-derived DCs from RA patients and healthy controls, modulated with dexamethasone and activated MPLA (DM-DCs). There were no differences found between DM-DCs from RA patients and healthy controls, showing that the generation protocol with Dex and MPLA can remove the disease effect over DCs phenotype and transcriptome perceived in unstimulated DCs. DM-DCs exhibited a particular transcriptomic profile, from which we identified sets of genes modulated either by Dex or MPLA, but also found a set of genes which responded only to a synergic effect of Dex and MPLA. Amongst these, we found several genes related to DCs differentiation and regulatory function, including some transcription factors. The differential expression of 30 genes of interest was assessed by real time PCR, and for 20 these genes the protein levels could also be confirmed by flow cytometry. Amongst target genes, we could confirm the potential of MYC as a transcriptional regulator of tolerance-related genes in DM-DCs through inhibition assays, supporting its participation in the regulatory function of DM-DCs. Functional enrichment analyses showed that chemotaxis, cell-to-cell signaling and interaction, fatty acid oxidation as well as oxidative metabolism and zinc homeostasis were among the main biological functions represented in the data set. ROS production and Zinc homeostasis seemed to play an important role in DM-DCs profile, since we could corroborate a higher intracellular expression of both molecules in these cells, compared to unstimulated and mature controls. At last, in the second part of this project, seeking to evaluate the expression of tolerancerelated genes previously identified and over-expressed in DM-DCs, in inflammatory DCs (InfDCs) from synovia of RA patients, we confirmed a lower expression of JAG1, MERTK and IDO1 in these cells. These InfDCs, in contrast, exhibited higher expression of maturation-related genes, similar to what was observed when DCs derived from RA patient’s monocytes were differentiated in the presence of synovial fluid or TNF. Taken these results together, we can infer that DM-DCs display a distinctive transcriptional and phenotypic profile, which differentiates them from other DCs subsets, and this is due to the upregulation of several tolerance related-genes driving the regulatory differentiation and function of DMDCs.