Asociación entre las variantes de la región enhancer de la Timidilato Sintasa (TSER) y expresión de la proteína Timidilato Sintasa (TS) en pacientes chilenos con cáncer colorrectal

Abstract

Introducción: El cáncer es la segunda causa de muerte en Chile, y el digestivo es responsable del 46,2% del total de los fallecimientos por esa causa; de ellos, el cáncer colorrectal (CCR) es la tercera causa de muerte después del gástrico y biliar. Entre los fármacos más empleados para el tratamiento del CCR se encuentran los análogos de las pirimidinas (5-FU y su pro droga Capecitabina), que tienen como blanco de acción a la enzima Timidilato Sintasa (TS), que cumple un rol clave en la síntesis de DNA. La respuesta a este tratamiento no es igual para todos los individuos, se ha postulado que la resistencia farmacológica en algunos pacientes, se debería a la presencia de variantes genéticas en la región enhancer del gen TS, que producirían modificaciones cuantitativas y/o cualitativas de la enzima TS.La farmacogenética ha logrado avances en la búsqueda de marcadores biológicos que están permitiendo predecir la respuesta interindividual a las terapias farmacológicas. Los estudios clínicos realizados en pacientes con CCR sugieren que el locus TSER (Thymidilate Synthase Enhancer Region)sería un buen indicador de la respuesta al tratamiento a los análogos de la pirimidinas. En todas las poblaciones estudiadas, se ha descrito, la presencia de dos polimorfismos en el locus TSER, el primero consiste en un VNTR (variable number tandem repeats), de 28 pares de bases (pb) que origina los alelos TSER*2 y TSER*3, y el segundo en un SNP (single nucleotide polymorphism), que produce unasustitución nucleotídica G>C, dentro de la segunda repetición del alelo TSER*3. Ambos afectarían la expresión de la proteína TS. Objetivo:Discernir larelación entre las variantes genotípicas del locus TSER y la expresión de la proteína TS en tejido normal y tumoral en pacientes chilenos con cáncer de colon y/o recto. Pacientes y muestras: En el presente estudio participaron 53 pacientes con CCR, atendidos en el Hospital San Juan de Dios-Santiago de Chile, de las biopsias fijadas en formalina e incluidas en parafina se obtuvo muestras de tejido normal y tumoral. Métodos: Se genotipificaron las muestras de los distintos individuos de acuerdo a los dos polimorfismos descritos para el locus TSER. Se emplearon las técnicas de PCR para las dobles y triples repeticiones en tándem de 28pb y RFLP para la sustitución G>C, ubicada en la segunda repetición del alelo TSER*3. Mientras que la expresión intratumoral de la proteína TS fue evaluada por inmunohistoquímica (IHQ) en tejido fijado e incluido en parafina. Resultados: Las frecuencias genotípicas para el locus TSER según VNTR y SNP (G>C) en tejido normal fueron las siguientes: TSER*2/*2 (22,6%), TSER*2/*3C (15,1%), TSER*2/*3G (35,9%), TSER*3C/*3C (3,8%), TSER*3G/*3C (15,1%), TSER*3G/*3G (7,6%). Se observó pérdida de heterocigocidad en tejido tumoral en individuos con genotipo TSER*2/*3C (3,8%) y TSER*2/*3G (11,4%), generando los genotipos TSER*2/-- (5,7%), TSER*3C/-- (1,9%) y TSER*3G/-- (7,6%). Se encontró asociación estadísticamente significativa (P< 0.05) entre las variantes genotípicas del locus TSER y la expresión de proteína TS en tejido normal y tumoral. Conclusiones: Hemos encontrado que la mayor expresión de la proteína se asocia fuertemente con la presencia de los genotipos que tienen al menos un alelo TSER*3G. Por lo tanto la genotipificación en tejido normal y tumoral de los polimorfismos ya descritos, podrían servir como potenciales predictores de la eficacia de los tratamientos con 5-FU en pacientes chilenos con diferentes tipos de cánceres. Se requieren más estudios para clarificar el verdadero rol que estarían jugando estos polimorfismos en el tratamiento con 5-FU en nuestra población.

Introduction: Cancer is the second leading cause of death in Chile, and the tract is responsible for 46.2% of total deaths for that cause, of which colorectal cancer (CRC) is the third leading cause of death after gastric and bile. Among the most commonly used drugs for the treatment of CRC are pyrimidine analogs (5-FU and its pro-drug Capecitabine), which target the enzyme action Thymidylate Synthase (TS), which plays a key role in the DNA synthesis. The response to this treatment is not the same for all individuals, it has been postulated that the drug resistance in some patients, be due to the presence of genetic variants in the region TS gene enhancer, which produce modifications quantitative and/or qualitative of TS enzyme.Pharmacogenetics has made progress in the search for biomarkers that predict response are allowing interindividual to pharmacological therapies. Clinical studies in patients with CRC suggest that TSER locus (Thymidylate Synthase Enhancer Region) would be a good indicator of treatment response to pyrimidine analogs. In all populations studied, has been described, the presence of two polymorphisms in the TSER locus, the first is a VNTR (variable number tandem repeats) of 28 base pairs (bp) that originates TSER*2 allele and TSER*3, and the second in a SNP (single nucleotide polymorphism), which produces a nucleotide substitution G>C, in the second repeat of TSER*3 allele. Both affect the TS protein expression. Objective: To discern the relationship between the genotypic variants of locus TSER and TS protein expression in normal and tumor tissue in Chilean patients with colon and/or rectum. Patients and samples: The present study included 53 patients with CRC treated at the Hospital San Juan de Dios, Santiago, Chile, from biopsies fixed in formalin and embedded in paraffin samples obtained normal and tumor tissue. Methods: We genotyped samples from different individuals according to the two polymorphisms described for TSER locus. We used PCR techniques for double and triple tandem repeats of 28pb and RFLP for substitution G>C, located in the second repeat of TSER*3 allele. While the intratumoral expression of TS protein was evaluated by immunohistochemistry (IHC) on tissue fixed and embedded in paraffin. Results: The genotype frequencies for TSER according VNTR locus SNP (G>C) in normal tissue were: TSER*2/*2 (22.6%), TSER*2/*3C (15.1%), TSER*2/*3G (35.9%), TSER*3C/*3C (3.8%), TSER*3G/*3C (15.1%), TSER*3G/*3G (7.6%). Loss of heterozygosity (LOH) was observed in tumor tissue in individuals with genotype TSER*2/*3C (3.8%) and TSER*2*/3G (11.4%), generating genotype TSER*2/-- (5.7%), TSER*3C/-- (1.9%) and TSER*3G/-- (7.6%). Statistically significant association was found (P<0.05) between a locus TSER genotype and TS protein expression in normal and tumor tissue. Conclusions: Were found that the enhanced expression of the protein is strongly associated with the presence of the genotypes that have at least one allele TSER*3G. Therefore genotyping in normal and tumor tissue of the polymorphisms described above, could serve as potential predictors of efficacy of treatment with 5-FU in Chilean patients with different cancers. Further studies are needed to clarify the true role they would play these polymorphisms on treatment with 5-FU in our population.