Distribución del comportamiento intermedio retículo endoplásmico-golgi mediante microscopía de reconstrucción óptica estocástica "STORM" en axones de nervio ciático de ratón

Abstract

Los axones son especializaciones tubulares de diámetro micrométrico que pueden llegar a tener longitudes del orden de varios metros, constituyendo el compartimento más extenso de las neuronas en términos de longitud y de superficie total. Su función es la propagación de los impulsos eléctricos. Los axones mielinizados son aquellos recubiertos por vainas de mielina, lo que divide al axón en distintos dominios incluyendo nodos de Ranvier, entre una vaina y la siguiente; paranodos; yuxtaparanodos, e internodos. Estos dominios agrupan a los canales iónicos en zonas específicas, mientras que la vaina de mielina aumenta la velocidad de conducción. Para sustentar la compleja morfología y función del axón, las neuronas requieren de un sistema preciso y eficiente de distribución de lípidos y proteínas. Evidencia reciente indica que el transporte vesicular de proteínas desde el cuerpo neuronal (soma) hacia el axón no es suficiente para dar cuenta de estas necesidades, especialmente en condiciones de crecimiento, plasticidad o reparación. Por lo tanto, se ha propuesto como alternativa el transporte de RNA mensajeros y la síntesis proteica local en axones. Este mecanismo ha sido bien documentado para proteínas solubles y elementos del citoesqueleto. Sin embargo, la evidencia que sustenta la síntesis y destinación local de proteínas secretadas o de transmembrana, que requerirían de una ruta secretoria axonal para su correcta destinación, es fragmentaria y tanto la distribución como la relación entre sus componentes estructurales no ha sido bien establecida. En este trabajo combinamos immunofluorescencia de células en cultivo y axones de nervio ciático de ratón, con microscopía de superresolución y un análisis de correlación matemático, para aclarar la distribución a nanoescala de un componente esencial de la ruta secretoria en axones: el Compartimiento Intermedio entre Retículo Endoplásmico y Golgi (ERGIC). Descubrimos diferencias en cuanto a densidad de partículas de ERGIC-53/p58 (marcador de ERGIC) en los distintos dominios axonales, existiendo una mayor densidad en el nodo, seguido por el internodo y por último el paranodo. Además, encontramos que los dominios axonales difieren en cuanto al tamaño de sus agrupaciones de partículas: en el nodo y el paranodo encontramos agrupaciones de alrededor de 300 nm y en el internodo de 400 nm a 600 nm. Estas diferencias podrían deberse a limitantes morfológicas del axón, en particular a la constricción que existe en el paranodo y nodo, pero también podría significar diferencias funcionales del ERGIC en los distintos dominios, como, por ejemplo, una mayor velocidad de tráfico de proteínas en los internodos en comparación a los otros dominios.

Axons are tubular specializations of micrometric diameter and lengths in the order of several meters, constituting the most extensive compartment of neurons in terms of length and total surface. The function of axons is the propagation of electrical impulses. Myelinated axons are those covered by myelin sheaths, which divide the axon into different domains including Ranvier nodes, between one sheath and the next; paranodes; juxtaparanodes, and internodes. These domains group the ion channels in specific zones, and the myelin sheath increases conduction speed. To support the complex morphology and function of the axon, neurons require a precise and efficient distribution of lipids and proteins. Recent evidence indicates that the vesicular transport of proteins from the neuronal body (soma) to the axon is not enough to account for these needs, especially in conditions of growth, plasticity or repair. Therefore, the transport of messenger RNAs and local protein synthesis in axons has been proposed as an alternative. This mechanism has been well documented for soluble proteins and elements of the cytoskeleton. However, the evidence supporting the synthesis and local trafficking of secreted or transmembrane proteins, which would require an axonal secretory route for its correct destination, is fragmentary and both the distribution and the relationship between its structural components has not been well established. In this work we combine immunofluorescence of culture cells and axons of mouse sciatic nerve, with superresolution microscopy and a mathematical correlation analysis, to clarify the nanoscale distribution of an essential component of the secretory pathway in axons: the ERGolgi Intermediate Compartment (ERGIC). We discovered differences in particle density of ERGIC-53 / p58 (ERGIC marker) in the different axonal domains, there being a higher density in the node, followed by the internode and finally the paranode. In addition, we found that the axonal domains differ in the size of their particle clusters: in the node and the paranode we found clusters of around 300 nm and in the internode of 400 nm to 600 nm. These differences could be due to morphological limitations of the axon, in particular to the constriction that exists in the paranode and node, but it could also produce functional differences of the ERGIC in the different domains, such as, for example, a higher protein trafficking speed in the internodes compared to the other domains.