Efecto de la actividad masticatoria sobre la producción y liberación de IL-1ß e IL-6 a través de la señalización por ATP extracelular en fibras de músculo masetero de ratón

Abstract

Los músculos masticatorios (masetero, temporal, pterigoideos lateral y medial, vientre anterior del digástrico y milohioideo) forman parte de la articulación temporomandibular (ATM), que corresponde a una de las articulaciones más activas y complejas del cuerpo. Debido a esto, es susceptible a sufrir cambios adaptativos y/o patológicos que conllevan a la liberación de citoquinas como interleuquina-1β (IL-1β) e interleuquina-6 (IL-6) local. Pese a que ambas citoquinas son consideradas proinflamatorias, también se han relacionado con procesos de plasticidad y adaptación muscular. Si bien los músculos masticatorios son un componente importante en la ATM, poco se sabe respecto a la liberación de IL-1β e IL-6 desde estas fibras musculares, y si su producción se relaciona con cambios en la actividad muscular en condiciones fisiológicas. Estudios previos en modelos murinos han relacionado la producción de estas citoquinas con la actividad contráctil del músculo masetero; no obstante, se desconoce si su producción y liberación es directamente desde las fibras musculares y tampoco se ha abordado el mecanismo molecular involucrado. Un mecanismo que permite relacionar la actividad muscular y la expresión de citoquinas, y que ha sido demostrado en miotubos y músculos de las extremidades, es el acoplamiento excitación-transcripción (AET), en el que la despolarización de la membrana muscular promueve la salida de ATP que, vía activación de receptores P2X/P2Y, regula la expresión génica. Se ha reportado que el AET es uno de los mecanismos que controla la expresión y secreción de IL-6 en músculos de las extremidades. No obstante, no se ha determinado si este mecanismo participa en la inducción de IL-6 y otras citoquinas como la IL-1β en fibras adultas de músculo masetero. En nuestro laboratorio hemos detectado que en músculo masetero de ratón se expresa ARNm y proteínas de componentes fundamentales para el AET, y por ello la hipótesis de esta tesis plantea que “La actividad del músculo masetero de ratones adultos promueve la producción y liberación de IL-1β e IL-6 a través de la señalización por ATP extracelular”. Para abordar esta hipótesis, utilizamos un modelo de estimulación eléctrica de músculo masetero de ratón in vitro, para evaluar la liberación de IL-1β e IL-6 y su dependencia de la ruta de ATP extracelular (ATPe). Paralelamente, establecimos un modelo de plasticidad de músculo masetero de ratón adulto (6- 8 semanas) in vivo, por cambios en la actividad masticatoria. En ese modelo se evaluaron cambios en la producción de mioquinas en músculo masetero, y su dependencia de la ruta de ATPe. Los resultados mostraron que la estimulación eléctrica (EE, 270 pulsos-0.3 ms, 20-90 Hz) promueve la expresión, producción y liberación de IL-1β e IL-6 en músculo masetero de ratón, de manera dependiente de ATP extracelular. El ATP exógeno indujo el mismo efecto, de manera tiempo y concentración-dependiente. La EE también promovió la liberación de ATP al espacio extracelular de manera dependiente de la frecuencia de estimulación, con un máximo a los 20 Hz. Cuando se bloqueó la ruta de señalización por ATP extracelular, no hubo efecto de la EE o ATP exógeno sobre la producción de IL-1β e IL-6 en músculo masetero. Por otro lado, cambios en la actividad masticatoria promovieron plasticidad muscular en el músculo masetero, con aumento en el diámetro de las fibras musculares con la hiperfunción y disminución del diámetro con la hipofunción masticatoria. La hiperfunción masticatoria modificó los niveles de liberación de ATP, reduciendo los niveles basales y aumentando los inducidos por EE. Interesantemente, ambas condiciones aumentaron el nivel basal de expresión de IL-1β e IL-6 en músculo masetero, pero disminuyeron la tasa de aumento de ambas mioquinas estimulado por EE o ATP exógeno. La metabolización del ATPe utilizando la enzima apirasa, disminuyó el nivel basal de IL-1β e IL-6 en músculo de animales con hipofunción e hiperfunción, igualándolos a lo observado en el grupo control. Finalmente, al evaluar los componentes de la ruta de señalización por ATPe, se observó que la hiperfunción e hipofunción aumentan los niveles de receptor P2Y2 y, en el caso del grupo con hiperfunción, también de Pnx-1. Los resultados obtenidos demuestran por primera vez que la ruta de señalización por ATPe está presente y activa en músculos masticatorios. Por otro lado, la actividad del músculo masetero, tanto en condiciones in vitro como in vivo, promueve la expresión de IL-1β e IL-6 de manera dependiente de la señalización por ATPe. Cambios en la actividad masticatoria modifican estructural y funcionalmente esta ruta de señalización, impactando directamente en la producción de mioquinas desde estos músculos. Este trabajo abre un área de estudio relevante para comprender las implicancias de la producción de IL-1β e IL-6 desde músculos masticatorios, que puede impactar en la adaptación de músculos y tejidos adyacentes en salud y enfermedad.

The masticatory muscles (masseter, temporal, lateral and medial pterygoid) are part of the temporomandibular joint (TMJ), which corresponds to one of the most active and complex joints in the body. Due to this, it is susceptible to adaptive and pathological changes that lead to the local release of cytokines such as interleukin-1β (IL-1β) and interleukin-6 (IL-6). Although both cytokines are considered pro-inflammatory, they have also been related to plasticity and muscle adaptation. Although masticatory muscles are an important component in TMJ, little is known about the release of IL-1β and IL-6 from them, and whether their production is related to changes in muscle activity under physiological conditions. Previous studies in murine models have linked the production of these cytokines with the contractile activity of the masseter muscle. However, it is unknown whether its production and release are directly from the muscle fibers as well as the molecular mechanism involved in that. A mechanism that relates the muscular activity and the expression of cytokines, and that has been demonstrated in myotubes and limb muscles, is the excitation-transcription coupling (ETC), in which the depolarization of the muscular membrane promotes the release of ATP that, via activation of P2X / P2Y receptors, regulates gene expression. It has been reported that ETC is one of the mechanisms that controls the expression and secretion of IL-6 in limb muscles. However, it has not been determined whether this mechanism participates in the induction of IL-6 and other cytokines such as IL-1β in adult masseter muscle fibers. In our laboratory, we have detected that mouse masseter muscle expresses mRNA and proteins of fundamental components for the ETC, and therefore the hypothesis of this thesis states that "The activity of the masseter muscle of adult mice promotes the production and release of IL1β and IL-6 through signaling by extracellular ATP". To address this hypothesis, we used an Finally, when evaluating the components of the eATP signaling pathway, it was observed that the masticatory hyperfunction and hypofunction increased the P2Y2 receptor levels and, in the case of the hyperfunction, also of Pnx-1. These results demonstrate for the first time that the eATP signaling pathway is present and active in masticatory muscles. On the other hand, the activity of the masseter muscle, both in vitro and in vivo, promotes the expression of IL-1β and IL-6 in an eATP-dependent manner. Changes in masticatory activity structurally and functionally modify this signaling pathway, directly impacting the production of myokines from these muscles. This work opens a relevant field to understand the implications of the production of IL-1β and IL-6 from masticatory muscles, which can impact the adaptation of muscles and adjacent tissues (bone, cartilage) in health and disease.