Señalización de TGF-β1 y su relación con caveolina-1 en fibroblastos cardíacos diferenciados de rata adulta

Abstract

Luego de un infarto al miocardio, el corazón se repara mediante un proceso denominado fibrosis cardíaca, en el cual los cardiomiocitos muertos son reemplazados por una cicatriz de matriz extracelular (MEC), conformada principalmente por colágeno tipo I (COL I) y EDA-fibronectina (EDA-FN). Estas proteínas son secretadas por los miofibroblastos cardíacos (MFC), un fenotipo altamente secretor y contráctil debido a la expresión de fibras de α-SMA. Se obtienen por diferenciación celular de fibroblastos cardíacos (FC), promovida por el Factor de Crecimiento Transformante β1 (TGF-β1), un factor pleiotrópico con múltiples funciones fisiológicas de proliferación, diferenciación celular, regeneración y homeostasis de tejidos. TGF-β1 al unirse a su receptor puede señalizar mediante una vía canónica de proteínas Smads y no-canónica de proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs), sin embargó estas vías pueden intercomunicarse río abajo. Hay antecedentes que indican que para la señalización de TGF-β1 es necesaria la endocitosis del complejo receptor-ligando vía clatrina, mientras que la endocitosis vía caveolas lleva al reciclaje del receptor de TGF-β1. Las caveolas conocidas como invaginaciones de la membrana plasmática están compuestas por proteínas caveolinas. Estas además de tener un rol estructural en la caveola cumplen con un rol de plataforma de señalización, por la ubicación de distintos receptores de una misma vía en las caveolas. Se ha reportado que la proteína caveolina-1 (CAV1) es la principal isoforma asociada a ECV. Esta regula negativamente la señalización de TGF-β1 impidiendo la fosforilación de proteínas smads y la expresión de fibras de α-SMA en línea celular de fibroblastos embrionarios. En fibroblastos pulmonares embrionarios de origen humano (IMR-90) se ha reportado que TGF-β1 puede regular negativamente los niveles de CAV1 en dosis y tiempo dependencia. En modelos in vivo se ha visto que en ratones CAV1 -/- se favorece una permanencia en el tiempo el desarrollo de fibrosis cardíaca aumentando la deposición de COL I intersticial y disminuyendo la expresión de metaloproteínasas específicas para COL I. Por otra parte, se ha indicado que hay una relación entre la disminución de los niveles de CAV1 y una hiperactivación de la vía MAPK-ERK 1/2, la cual a su vez esta vía se asocia a la síntesis de colágeno tipo I. Los antecedentes que se conocen nos indican que se asocia una disminución de los niveles de CAV1 con una señalización positiva de TGF-β1 y a una hiperactivación de la vía ERK 1/2. Pero no se conoce si hay una regulación de TGF-β1 sobre los niveles de CAV1, ni tampoco posibles mecanismos en esta regulación en FCs diferenciados. Por lo que para responder a la problemática planteada se propuso la siguiente hipótesis: “TGF-β1 disminuye los niveles de caveolina-1 mediante vía ERK y aumenta los marcadores de fibrosis: colágeno I y EDA-fibronectina, en fibroblastos cardíacos diferenciados de rata adulta”. Para comprobar esta hipótesis se tomaron FC y se diferenciaron a MFC con TGF-β1 por 96 hrs, por lo que en una primera instancia se validó el modelo in vitro mediante la cuantificación de parámetros de fibrosis; pro-COL I y EDA-FN por técnica de western blot (WB), la secreción de COL I soluble por tinción de Sirius Red, y el marcador de MFC; α-SMA por WB y la formación de fibras por inmunofluorescencia (IF). En una segunda instancia, se evaluó el efecto de TGF-β1 sobre los niveles de CAV1 cuantificados por WB. Por último, para atribuirle una función distintiva a la vía ERK, se procedió a inhibir esta y la vía Smad por separado, y estudiar el efecto sobre los niveles de CAV1 y los parámetros de fibrosis por WB y tinción de Sirius red. De la validación del modelo in vitro se observó que con 10 ng/ml de TGF-β1 por 96 hrs se obtuvieron niveles aumentados significativos de EDA-FN y COL I soluble, pero no se observó diferencias de pro-COL I respecto al control. Respecto al marcador de α-SMA, no hubo diferencias significativas en sus niveles proteicos, pero sí se observó la formación de fibras de α-SMA por IF. Luego se determinó que TGF-β1 disminuye significativamente los niveles de CAV1 independiente de una dosis dependencia. Finalmente, se observó que esta disminución no fue prevenida al inhibir la vía ERK y Smad, pero el aumento en los niveles de EDA-FN y COL I soluble sí fueron prevenidos al inhibir ambas vías. En esta memoria se concluyó que TGF-β1 regula negativamente los niveles de CAV1 y que esta regulación es independiente de la vía ERK y Smad, a pesar de que los parámetros fibróticos son regulados por ambas vías

Objective: TGF-β1 is the main stimuli to differentiate cardiac fibroblasts (CF) in cardiac myofibroblasts (CMF), the principal event in fibrosis. It has seen low levels of caveolin-1 (CAV1) after an injury to the heart. Also, it was reported a negatively regulation in TGF-β1 canonical Smad and non-canonical ERK signaling by CAV1 in distinct models of fibrosis, but it is unknown if TGF-β1 can regulate CAV1 and an associated molecular mechanism in cardiac fibrogenesis. Methods: CF were taken and differentiated with TGF-β1 (0-20 ng/mL) for 96 hrs. The model was validated by quantifying fibrosis markers (pro-COL I, EDA-FN by western blot (WB) and soluble COL I by Sirius red staining) and CMF marker (α-SMA levels by WB and fibers of α-SMA by inmufluorescence (IF)). ERK and Smad pathway was inhibited by PD98059 (10 μM) and SD208 (200 nM) inhibitors, respectively previous TGF-β1 treatment for 96 hrs. CAV1 levels and fibrotic makers (EDA-FN and soluble COL I) were quantified. Results: The model was validated with 10 ng/mL of TGF β1 for 96 hrs and significant increases levels of EDA-FN and soluble COL I were obtained. No differences were appreciated in pro-COL I synthesis in contrast to control without treatment. Also, no differences were observed in α-SMA protein levels, but the formation of α-SMA fiber by IF was observed. Along with this it was seen an effective down-regulation of CAV1 by TGF β1, but this regulation was ERK and Smad independent pathway, unlike the regulation of fibrotic parameters. Conclusion: In this report we concluded that TGF-β1 negatively regulated CAV1 levels independently of ERK and Smad pathway in CF differentiated