Diseño de micropartículas de flavonoides: estudio de la cristalinidad y agente canalizante sobre la estabilidad oxidativa de matrices lipídicas

Abstract

Es conocido que la presencia de antioxidantes puede incrementar la estabilidad oxidativa de los aceites y retardar su oxidación, debido a que la oxidación lipídica es la reacción que causa el deterioro de las materias grasas, conduciendo a la formación de compuestos que causan alteraciones organolépticas y nutricionales. Los flavonoides, debido a su actividad antioxidante y sus propiedades biológicas podrían ser usados como una potencial alternativa a los antioxidantes sintéticos. Sin embargo, debido a su inestabilidad y solubilidad, su aplicación directa a matrices alimenticias es limitada. La microencapsulación representa una estrategia que permite proteger y controlar la liberación de los flavonoides y superar la utilización inefectiva del flavonoide en matrices lipídicas. El diseño de micropartículas por secado con atomización conduce a la formación de partículas sólidas que generalmente son de naturaleza amorfa. Diferentes grados de cristalización de los polvos, pueden ser obtenidos controlando las condiciones operacionales en el secado y la formulación de las dispersiones, lo que representa una buena estrategia para controlar otras propiedades físicas de las micropartículas y sus aplicaciones. Otra alternativa importante en la encapsulación de flavonoides es el diseño de micropartículas de liberación controlada, mediante la utilización de polímeros con distinta solubilidad en la matriz lipídica, un polímero insoluble en lípidos (agente encapsulante) y un polímero soluble en lípido (bajo porcentaje) que podrían permitir la liberación controlada de los flavonoides para incrementar la estabilidad oxidativa. Con base a estos antecedentes, el objetivo de esta investigación fue estudiar dos modelos de micropartículas de flavonoides: primero micropartículas con distinto grado de cristalinidad (amorfo-semicristalino) y después micropartículas sin y con la incorporación de un agente canalizante (polímero formador de canales), para evaluar su efecto en el incremento de la estabilidad oxidativa de dos matrices lipídicas: linoleato de metilo (LM) y aceite de girasol (AG). Micropartículas de epicatequina (E) y quercetina (Q) con distinto grado de cristalinidad, se encapsularon utilizando inulina (E-In y Q-In), la relación flavonoide/In fue de 1:41 y 1:43 respectivamente, la temperatura del aire de entrada al secador fue de 160 ºC y se emplearon dos temperaturas de alimentación (15 y 90 ºC) de las soluciones (E-In-15, E-In-90, Q-In-15 y Q-In-90) y micropartículas de inulina sin flavonoides (In-15 y In-90), fueron usadas como control. Las propiedades físicas de las micropartículas (E-In-15, E-In-90, Q-In-15 y Q-In-90, In-15 y In-90) fueron estudiadas por calorimetría diferencial de barrido (DSC) y difracción de rayos X (DRX). Además, se usó microscopía electrónica de barrido (SEM) y difracción de luz laser (DLL) para la caracterización de las partículas. Todos los sistemas elaborados con temperatura de alimentación de 15 ºC (In-15, E-In-15, Q-In-15) presentaron mayor grado de cristalinidad y la eficiencia de encapsulación (EE) fue significativamente mayor (p≤0,05), sobre el 67% con respecto a las formuladas a mayor temperatura (90 ºC) de alimentación (E-In-90 y Q-In-90) que se caracterizaron por presentar predominio de zonas amorfas. La recuperación de flavonoides (E y Q) alcanzó valores sobre 75% para todos los sistemas estudiados (amorfo-semicristalino). La estabilidad oxidativa se evaluó a través de almacenamiento acelerado a 60 ºC (Rancimat), formación de compuestos polares (columna de adsorción) y la distribución de compuestos de oxidación (HPSEC), empleando LM y AG como matrices lipídicas. Se realizaron ensayos de estabilidad oxidativa en LM y AG con la adición de micropartículas (E-In-15, E-In-90, Q-In-15 y Q-In-90) a razón de 200 mg/k LM y AG durante almacenamiento acelerado (Rancimat) a 60 ºC. Se observó que los tiempos de inducción (TI) fueron significativamente mayores (p≤0,05) para los sistemas con LM+Q-In-90 y AG+Q-In-90. En los estudios realizados por almacenamiento en placa (60 ºC), la formación de compuestos polares (columna de adsorción) también fue significativamente menor para los sistemas con AG+Q-In-90. En general, los resultados mostraron que el estado físico de las micropartículas (grado de cristalinidad), la estructura química del flavonoide y en particular de la Q, tiene una considerable importancia en la aplicación y el incremento de la estabilidad oxidativa de aceites. Con respecto a la optimización de micropartículas de flavonoides (epicatequina E, naringenina N y quercetina Q) con inulina como agente encapsulante y aislado proteico de soya (APS) como agente formador de canales, se elaboraron de acuerdo con un diseño de Box-Behnken, con 15 experimentos para cada sistema (E-(In-APS), N-(In-APS) y Q-(In-APS)). Las variables independientes fueron: la relación flavonoide/agente encapsulante, temperatura del aire de entrada y contenido de APS. Las variables dependientes fueron: la EE y liberación de los flavonoides en hexano a los 14 días (t14) de almacenamiento. Las condiciones óptimas de encapsulación se determinaron por la metodología de superficie de respuesta (MSR) y aplicando la función deseabilidad. En todos los sistemas de micropartículas (E-(In-APS), N-(In-APS) y Q-(In-APS) mostraron que el contenido de agente canalizante (APS) presentó un efecto significativo (p≤0,05) sobre la liberación de los flavonoides indicando que fue la variable independiente con un efecto positivo mayor. El estudio de la formación de canales en las micropartículas de flavonoides-(In APS) que contienen APS se realizó mediante la técnica de microscopía confocal utilizando rojo nilo (0,1%) como fluorocromo el cual se disolvió en el AG (sistemas de 3 g de AG con rojo de Nilo y micropartículas sin y con APS (Q-In y Q-(In-APS)) en concentración equivalente a 200 mg flavonoide/Kg que fueron agitadas constantemente durante 14 días en una placa calefactora a 60 °C. Los resultados mostraron que el APS es capaz de inducir la formación de canales dentro de la micropartícula mediante la disolución del APS por el aceite, favoreciendo la interacción entre los flavonoides y el AG y su difusión hacia el aceite donde ejerce su actividad antioxidante .Para evaluar el efecto del agente canalizante (APS) se realizaron ensayos de estabilidad oxidativa (Rancimat), se prepararon sistemas de micropartículas con APS de E-(In-APS), N-(In-APS) y Q-(In-APS) (200 mg/kg) con la formulación óptima de F/In y temperatura del aire de entrada al secador, mientras que el contenido de APS se fijó en un 5% (respecto a la inulina), para que los sistemas fueran comparables. Micropartículas de flavonoide-In sin agente canalizante fueron usadas como control (E-In, N-In y Q-In). El estudio de la estabilidad oxidativa mostró que la adición de flavonoides encapsulados al LM y AG produjo un aumento significativo en el TI y el factor de protección y fue mayor para los sistemas de LM + Q-(In-APS) y AG+ Q-(In-APS). Además, disminuyeron significativamente la formación de compuestos polares y se retardaron las reacciones de polimerización. Contrariamente los sistemas con N sin y con APS no ejercieron ningún efecto sobre la estabilidad oxidativa (TI) y por lo tanto no fueron considerados en los estudios posteriores. En esta investigación se observó que la encapsulación de flavonoides en los distintos sistemas de micropartículas (distinto grado de cristalinidad) y en micropartículas con la incorporación de APS (agente formador de canales) constituyen efectivos diseños para la liberación de los flavonoides y determinan la aplicabilidad de las micropartículas en matrices lipídicas

It is well known that the presence of antioxidants can increase the oxidative stability and delay the oxidation of oils due to the fact that lipid oxidation is one of the main reactions that cause the deterioration of fats, giving rise to compounds that are responsable for organoleptic and nutritional changes. The flavonoids, due to their antioxidant activity and biological properties, represent a potential alternative to synthetic antioxidants. However, the incorporation of free flavonoids into food systems has some drawbacks since they show limited solubility and stability. Microencapsulation could enhance the stability of flavonoids, control their release into lipid systems, and overcome their ineffectual usage in lipid matrices. The design of microparticles prepared by spray drying leads to solid particles, but these are usually amorphous. Different degrees of crystallization can be achieved in the powder materials and controlled by maintaining appropriate operating conditions within the dryer and formulation of the liquid materials, and this is a useful strategy to control other physical properties of microparticles and their applications. Another important possibility is the design of flavonoid microparticles for controlled release using polymers with different solubility in the lipid matrix. A lipid-insoluble polymer (encapsulating agent) and a lipid-soluble polymer (in a low percentage), could allow the release of flavonoids, to improve oxidative stability in a lipid system. Based on the abovementioned background, the goal of this research was to study two models of flavonoid microparticles: first, microparticles with different degrees of crystallinity (amorphous or semicrystalline) and then, microparticles with and without the addition of a channeling agent (a channel-forming polymer), to assess their effects on the oxidative stability of two lipid matrices, methyl linoleate (ML) and sunflower oil (SO). Epicatechin (E) and quercetin (Q) microparticles with different degrees of crystallinity were encapsulated by spray-drying, using inulin (E-In and Q-In), in the flavonoid/encapsulating agent ratios 1:41 and 1:43 respectively, with inlet air temperature 160 °C, and feed temperatures 15 and 90 °C (E-In-15, E-In-90, Q-In-15 y Q-In-90). Inulin microparticles without flavonoids were used as controls (In-15 y In-90). The physical properties of the microparticles were evaluated by differential scanning calorimetry (DSC) and X-ray diffraction (DRX). In addition, scanning electron microscopy (SEM) and laser light diffraction (DLL) were used to characterize the surface and particle shape of the powder. All the systems prepared with a feed temperature of 15 ºC (In-15, E-In-15, Q-In-15) were more highly crystalline, and the encapsulation efficiency (EE) was significantly higher (p≤0,05) by 67%, whereas at higher feed temperatures (E-In-90 y Q-In-90), predominantly amorphous samples were obtained. The recovery of flavonoids (E and Q) was greater than 75% for all the studied systems (amorphous-semicrystalline). The oxidative stability was evaluated through accelerated storage at 60 ºC (Rancimat), formation of polar compounds were determined (by adsorption column chromatography), and the distribution of oxidation compounds was studied using HPSEC in ML and SO. Oxidative stability tests were performed in LM and AG with the addition of microparticles (E-In-15, E-In-90, Q-In-15 y Q-In-90) in amounts equivalent to 200 mg flavonoid/kg LM and AG using a Rancimat at 60°C. The induction periods (IP) were significantly higher (p≤0,05) for systems with LM + Q-In-90 and AG + Q-In-90. Assays after long-term storage (60° C), showed that the formation of polar compounds (adsorption column) was also significantly (p≤0,05) lower for systems with AG + Q-In-90. Overall, the results showed that the physical state of the microparticles (degree of crystallinity), and the chemical structure of the flavonoid, particulary Q, is very important for this application and to increase the oxidative stability of oils. Regarding the optimization of flavonoid microparticles (epicatechin E, naringenin N and quercetin Q) using Inulin (In) as the encapsulating agent, and soy protein isolate (SPI) as the channeling agent, a Box–Behnken design was used with 15 runs each (E–In–SPI, N-In-SPI and Q–In–SPI). The flavonoid/In ratio (1:20–1:50), inlet air temperature (120–160 °C), and SPI content (0–1.7 g) were evaluated as independent variables, whereas EE and flavonoid release into hexane at day 14 of storage (t14) were the dependent variables. Response surface methodology (RSM) and desirability function were used to determine the optimal conditions of flavonoid encapsulation for each system. All the microparticle systems (E-(In-APS), N-(In-APS) and Q-(In-APS) showed that the SPI content had a significant effect (p≤0,05) on flavonoid release, suggesting a larger positive effect of this independent variable. Confocal laser scanning microscopy was used to confirm the formation of channels within the flavonoid microparticle (In SPI) systems with SPI (Nile red 0.1% as the fluorochrome) was dissolved in SO (3g), and flavonoid microparticles (E–In, Q–In, E–In–SPI, and Q–In–SPI) were dispersed in amounts equivalent to 200 mg flavonoid/kg oil. The dispersions were stirred for 14 days on a heating block at 60 °C. The image results showed that SPI induces the formation of channels within the microparticle by dissolution of SPI molecules, forming channels inside the network and thus favoring the oil-encapsulated flavonoid interaction and its diffusion into the bulk oil. To evaluate the effect of the channeling agent (SPI), oxidative stability trials were done using flavonoid microparticles with SPI (E-(In-SPI), N-(In-SPI) and Q-(In-SPI) obtained under optimal conditions of flavonoid encapsulating agent ratio and inlet temperature of the dryer, keeping the SPI content at 5% (with respect to inulin), so that the systems were comparable. Flavonoid microparticles without SPI were used as controls (E-In, N-In and Q-In). The addition of encapsulated flavonoids to ML and SO caused a significant increase in the IP and the protection factor, and was higher for the LM + Q-(In-SPI) and AG+ Q-(In-SPI) systems. In addition, the formation of polar compounds decreased significantly and polymerization reactions were delayed. Conversely, systems with N either without or with SPI did not have any effect on oxidative stability (IP). This research showed that flavonoid encapsulation in the different microparticle systems (different degree of crystallinity) and microparticles with the incorporation of SPI (channel forming agent) are effective design features for flavonoid release and determine the applicability of microparticles in lipid matrices