Desarrollo de un biosensor electroquímico basado en MoS2 (molibdenita) para la detección de pesticidas

Abstract

Los biosensores son sistemas analíticos que contienen un elemento biológico sensible al analito el cual está anclado a una superficie transductora lo que permite una detección rápida, precisa y proporcional a la concentración del analito en estudio. Por otro lado, los nanomateriales en dos dimensiones (2D) han mostrado un gran potencial dado que presentan una mayor área efectiva y son susceptibles de ser funcionalizados, mejorando así las propiedades fisicoquímicas y la sensibilidad del biosensor. El principal objetivo de esta tesis fue el estudio y desarrollo de un biosensor electroquímico para la detección con alta sensibilidad de clorpirifos utilizando una superficie nanoestructurada de disulfuro de molibdeno (MoS2 – Molibdenita) y óxido de grafeno reducido (OGr) funcionalizada con L-cisteína y el posterior anclaje de la enzima acetilcolinesterasa (AChE). Para esto, se modificaron electrodos de carbono vítreo con nanoestructuras de MoS2 y OGr obtenidas a través de exfoliación química utilizando ultrasonido en medio de iso-propanol lo cual fue caracterizado a través de difracción de rayos X de polvo (DRX-Polvo), dispersión dinámica de luz (DLS) y microscopía electrónica de barrido (SEM). La posterior funcionalización con L-cisteína se caracterizó a través de DRX-Polvo y SEM. Los electrodos modificados también fueron caracterizados electroquímicamente a través de voltametría cíclica (VC) utilizando ferroceno metanol (FcOH) como mediador redox y tiocolina para estudiar la respuesta electroquímica frente al producto enzimático de la detección de clorpirifos. Se obtuvieron nanoestructuras del material híbrido MoS2/OGr de 136 ± 4 nm y un tamaño de cristalita de 2 nm. Los resultados obtenidos por VC indicaron que los materiales utilizados interaccionan entre sí y generaron un proceso sinérgico en la respuesta analítica. Además, por SEM se observó que el material permanece en la superficie del electrodo a pesar de haber estado sumergido a distintos tiempos en el proceso de funcionalización, y por VC se evidenció que la inmersión no interfirió en el proceso de oxidación de tiocolina. Posteriormente, se realizó un estudio bibliográfico de biosensores, similares a los propuestos en esta tesis, reportados durante los años 2016-2020, seleccionándose 15 artículos basados en la enzima acetilcolinesterasa. Para el anclaje de la enzima, se reportan métodos químicos y físicos, como técnicas de caracterización de los electrodos en esta etapa utilizaron VC, SEM y espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS). En todos los casos la señal de corriente producto de la oxidación de tiocolina generada por hidrólisis enzimática de acetiltiocolina permitió caracterizar la actividad enzimática. Luego, con el objetivo de obtener una metodología sensible y selectiva, los investigadores optimizaron parámetros como: pH del buffer fosfato, Tº del medio de reacción, concentración de material para modificar el electrodo y concentración de enzima. Utilizando la técnica voltametría de pulso diferencial para el análisis de los pesticidas los investigadores determinaron parámetros analíticos como sensibilidad, límite de detección, reproducibilidad y repetibilidad. Posteriormente, realizaron estudios de interferencias y estabilidad, reportando en algunos casos que a los 30 días los biosensores estudiados aún tienen más del 90% de actividad. Teniendo optimizadas las condiciones experimentales y obtenido el método analítico, diferentes pesticidas fueron analizados con cada biosensor, por ejemplo, en el grupo de los organofosforados: Ometoato, Paraoxón, Clorpirifos, Malatión, Triclorfón, entre otros y en el grupo de los carbamatos: Carbofurán, Isoprocarb y Carbaril. Para su detección, evaluaron el cambio en la actividad enzimática que experimente la AChE por la presencia del pesticida a través de amperometría y VC. La respuesta analítica exhibida en cada estudio disminuía en presencia del pesticida ya que este inhibió la enzima acetilcolinesterasa y, por ende, la producción de tiocolina. La reactivación de la enzima se llevó a cabo con buffer fosfato (PBS) y pralidoxima donde se obtuvo una reactivación de más del 90% en todos los casos estudiados. Los parámetros mencionados anteriormente dependieron del nanomaterial utilizado para construir cada biosensor por lo que los valores varían dependiendo de cada sistema. La respuesta electroquímica obtenida luego de exponer el biosensor con el pesticida exhibe el mismo comportamiento para todos los artículos estudiados. La señal analítica del biosensor disminuye cuando está en presencia del pesticida ya que éste forma un enlace covalente o no covalente con el sitio activo de la enzima, impidiendo la generación de tiocolina y por ende su oxidación

Biosensors are analytical systems which contain biological elements that react in the presence of an analyte and are attached to a transducer surface allowing the detection to be fast, precise and proportional to the concentration of the analyte. Besides, two dimensional nanomaterials (2D) have shown a high potential as active surfaces for biosensors as a result of their larger effective area and they can be functionalized to ensure the interaction between the surface and the biological element. The main objective of this thesis was to develop and study an electrochemical biosensor for a high sensitivity detection of chlorpyrifos using a nanostructured surface of molybdenum disulphide (MoS2 - Molybdenite) and reduced graphene oxide (OGr) functionalized with L-cysteine. This modification allowed to attach the acetylcholinesterase enzyme to the nanostructure. To make this possible, glassy carbon electrodes (GCE) were modified with the MoS2/OGr nanocomposites obtained through exfoliation using ultrasound in isopropanol media. GCE were characterized through X-Ray powder diffraction (DRX-Powder), dynamic light scattering (DLS) and Scanning Electron Microscopic (SEM). The modified electrodes were functionalized with L-Cysteine by immersion. The functionalized system was characterized by Powder-XRD and SEM. Modified electrodes were also electrochemically characterized by cyclic voltammetry (CV), using ferrocenemehtanol (FcOH) as a redox probe and acetylthiocholine to study the electrochemical response in a solution that contains the redox. Hydrodynamic diameter of 136 ± 4 nm (from DLS) and 2 nm (size of the crystallite from Debye-Scherrer equation) of MoS2/OGr were obtained, and the results of the Powder-XRD and CV showed that the materials utilized interacted and generated a synergistic effect of the analyte response. In addition, SEM micrograph showed that the material was still anchored to the electrode surface despite the fact that it had been immersed during different periods of time during the functionalization process. The voltammogram indicated that it didn’t interfere in the oxidation process of the acetylthiocholine. A bibliographic research about biosensors was carried out, these articles were similar to the articles proposed in this thesis from year 2016 to 2020. 15 articles were chosen based in acetylcholinesterase enzyme. For enzyme immobilization, investigators used physical and chemical methods. To characterized this, CV, EIS and SEM were used. In all cases, the current signal created by the thiocholine oxidation generated by enzymatic hydrolysis, allowed the characterization of the enzymatic activity. Subsequently, to obtain a sensitive and selective method, experimental conditions were optimized: pH of buffer phosphate, Tº of reaction medium, concentration of nanomaterial to electrode modification and concentration of enzyme. Using differential pulse voltammetry, investigators determined analytic parameters like sensitivity, low detection limit, reproducibility and repeatability. Then, they did interferences and stability studies reporting that after 30 days the biosensors retained 90% of activity. Besides, once the analytic method was obtained, several pesticides were tested in every article, as omethoate, paraoxon, chlorpyrifos, malathion, trichlorfon (organophosphorus pesticides) and carbophuran, isoprocarb and carbaryl (carbamate pesticides). For the pesticide detection, changes in enzymatic activity of the AChE in the presence of them was evaluated through Amperometry and CV. The analytic response decreased when the pesticide was detected due to the inhibition of the acetylcholinesterase enzyme, thus thiocholine production. The enzyme reactivation occurred with a Phosphate Buffer (PBS) and pralidoxime, every paper showed over a 90% of reactivation. Parameters that were mentioned depend on the nanomaterial used to build each biosensor, which is why their values varied depending on the system. The electrochemical obtained response after exposing the biosensor to the pesticide shows the same behaviour in every published study. The analytic signal of the biosensor decreased when the pesticide was detected because of the covalent or non-covalent bond in the active site of the enzyme, avoiding the production of thiocholine, thus its oxidation