Efecto del regulador transcripcional fur sobre la expresión de los genes icsA y rnaG en Shigella flexneri

Abstract

Shigella flexneri es un patógeno entérico, que afecta principalmente a niños menores de 5 años, ocasionando cuadros de diarrea acuosa con y sin sangre. En un porcentaje minoritario la enfermedad presenta su manifestación más severa, el síndrome disentérico, donde la diarrea con sangre es abundante, y que de no ser tratada, puede llegar a producir la muerte. Shigella spp presenta un ciclo de vida intracelular, para lo cual ha desarrollado sofisticados mecanismos que le permiten inducir su propia fagocitosis por parte de la célula blanco, el enterocito del colon. Para que este mecanismo de invasión sea posible, la bacteria posee un plásmido de virulencia, donde están codificados diversos factores que permiten explicar este fenotipo de Shigella spp, así como su capacidad de diseminar en el tejido colónico. La expresión de los genes del plásmido de virulencia está bajo el control del regulador plasmidial VirF, que gobierna entre otros, la llamada región de entrada, donde están codificadas las proteínas del sistema secretor tipo III, que media el ingreso de efectores a la célula hospedera. Para que la bacteria pueda avanzar a lo largo de la mucosa colónica, genera polímeros elongados a partir de la actina que forma parte del citoesqueleto de la célula infectada. En este proceso resulta esencial la participación de la proteína IcsA, factor de virulencia codificado en el plásmido, y encargado de iniciar la generación de estos polímeros o colas de actina. Enfrentada la bacteria a la temperatura corporal del hospedero, la transcripción de icsA se ve favorecida por el activador VirF, mientras que la regulación negativa es mediada por el RNA pequeño RnaG, reprimiendo su expresión. Además, otros factores ambientales gobiernan la expresión de los genes del plásmido de virulencia, dentro de ellos está la concentración de hierro, nutriente fundamental para los microorganismos, y cuya homeostasis está controlada por el regulador transcripcional Fur (Ferric uptake regulator) codificado en el genoma. La proteína Fur además puede controlar la transcripción de otros genes no involucrados en el metabolismo del hierro, como por ejemplo virF en el plásmido de virulencia. Fur también reprime la transcripción del RNA pequeño RyhB, el que a su vez reprime la transcripción de virB, regulador principal secundario del plásmido de virulencia. Análisis bioinformáticos y manuales realizados sobre la región promotora de icsA, y rnaG arrojaron la detección de secuencias blanco de unión a Fur, o cajas fur. Planteándose de este modo la hipótesis que esta proteína pueda regular la expresión de estos genes. Para ello se emplearon las estrategias de: fusiones transcripcionales para el análisis del efecto de Fur sobre la transcripción de las regiones promotoras de icsA y rnaG, y el ensayo de retardo en la migración, para evaluar si Fur puede unir a las regiones promotoras de icsA y rnaG. En primera instancia se procedió a la amplificación y clonamiento de las regiones promotoras de los genes icsA y rnaG en un vector de multicopia. Posteriormente, se liberó el inserto y se obtuvo una fusión transcripcional en un vector de expresión que controlaba la expresión del gen reportero lacZ. Adicionalmente, se realizaron construcciones similares donde en otro sitio de clonamiento del mismo vector, se clonó el gen fur sintetizándose una proteína funcional. Se midió el nivel de transcripción en presencia y ausencia de Fur mediante la determinación de la actividad β-galactosidasa, observándose que Fur es capaz de reprimir la transcripción de icsA, pero no la de rnaG, de forma significativa. Para evaluar si Fur une a las regiones promotoras estudiadas, se empleó la cepa reportera E. coli H1717. Esta cepa posee una fusión transcripcional en el cromosoma, el gen lacZ, que está bajo el control del promotor sensible a Fur, fhuf y fue utilizada para la detección de cajas fur mediante el ensayo FURTA. Al transformar esta cepa con los plásmidos recombinantes se obtuvo un resultado FURTA-positivo para icsA y FURTA-negativo para rnaG. Por último, se evaluó posibilidad que Fur pueda unir directamente las respectivas secuencias promotoras a través del ensayo de retardo en la migración de la corrida electroforética de DNA, EMSA. Para ello la proteína Fur fue purificada e incubada con las respectivas sondas de icsA y rnaG, observándose que la retención para icsA alcanza casi el 80%, mientras que para rnaG era de alrededor del 17% Los datos presentados en esta tesis sugieren que Fur es capaz de reprimir la expresión de icsA de forma directa a través de la unión a su secuencia promotora, mientras que no afecta la transcripción de rnaG de forma significativa.

Shigella flexneri is an enteric pathogen that mainly affects children under 5 years old, causing watery diarrhea with or without blood. While, the most severe illness, dysenteric syndrome, is present in a small percentage, diarrhea with abundant blood is presented, and if not treated, may cause death. Shigella spp has an intracellular life style, for what it has developed mechanisms allowing to induce its own phagocytosis by the target cell, the colonic enterocyte. To make possible this invasion mechanism, the virulence factors of the bacterium are encoded in a virulence plasmid, as well its capability to disseminate across the colonic tissue. The expression of genes within the virulence plasmid are under control of the VirF regulator, including the entry region, among others, where is encoded the type three secretion system, through which the effectors are secreted inside the host cell. To make possible for the bacterium to move across the colonic mucosa, it generates elongated actin polymers, in which process, IcsA has a crucial role. This virulence factor, encoded on the plasmid, is responsible of initiating the manufacture of these polymers or actin tails. The expression of icsA is positively regulated by the master regulator VirF, while it is strongly repressed by a sRNA, RnaG. This RNA is encoded in the complementary strand of icsA. Beside temperature, other environmental signals control the expression of the genes encoded on the virulence plasmid, among them is the iron concentration, an essential nutrient for all the microorganisms, which its homeostasis is under tight regulation by the transcriptional regulator Fur. Fur protein can also control the transcription of other genes not involved in iron metabolism, such as virF in the virulence plasmid. Fur also represses transcription of the small RNA RyhB, which in turn represses transcription of virB, secondary master regulator of the virulence plasmid. Bioinformatics analyzes on the promoter region of icsA, and rnaG allowed to detect binding sequences of Fur regulator, fur boxes. Thus, considering the hypothesis that this regulator may act on the regulation of these genes, a transcriptional fusions strategy was used, for analyzing the effect of Fur on the transcription of the of icsA and rnaG. A complementary strategy involved the electrophoretic mobility shift assay, to assess whether Fur could bind to the promoter regions of icsA and/or rnaG. We proceeded to the amplification and cloning of both promoter regions of genes icsA and rnaG into a multicopy plasmid. Subsequently, the insert was released and a transcriptional fusion was obtained into an expression vector, in which expression of the lacZ reporter gene is controlled by one of those promoter Additionally, similar constructions were made, where the fur gene coding for functional Fur protein was cloned into same expression vector. The transcription level was measured in the presence and absence of Fur by determining the β galactosidase activity. Fur was able to repress transcription of icsA, but not significantly to rnaG. To asses Fur binding to the promoter regions studied, the reporter strain, E. coli H1717, having a chromosomal transcriptional fusion with lacZ under the control of fhuF promoter, was used for detecting the fur boxes, by FURTA assay. By transforming this strain with the recombinant plasmids a FURTA-positive assay was observed with the icsA promoter. Finally, a pure Fur protein was able to bind and retard the electrophoretic migration of icsA promoter with almost 80% of retention, while for rnaG was around 17%. The data presented in this thesis suggest that Fur is able to repress the expression of icsA directly through the binding to its promoter sequence, while not affecting transcription of rnaG significantly.