Estudio de Pseudomonas ambientales aisladas desde tomates, su resistencia a agroquímicos, y el efecto de la resistencia a bacteriófagos en la motilidad.

Abstract

Chile se distingue por ser un importante productor de frutas y verduras a nivel mundial. Entre ellas, el tomate (Solanum lycopersicum) es una de las hortalizas más consumidas. Sin embargo, los cultivos suelen ser susceptibles a enfermedades bacterianas, cuyos brotes no controlados significan grandes pérdidas económicas. Se ha descrito la presencia de distintas especies de Pseudomonas en el suelo o de forma epífita en tejido vegetal y, aunque son consideradas inocuas, en ciertos casos han mostrado capacidad de infectar plantas de tomate de manera oportunista. Actualmente, dichas enfermedades son controladas por manejos culturales y aplicaciones preventivas de agroquímicos cúpricos y/o antibióticos. El uso desmedido de estos productos ha favorecido la selección de cepas bacterianas resistentes, disminuyendo la efectividad de estas medidas de control. Más aún, en el campo se han reportado cepas de Pseudomonas resistentes a cobre y estreptomicina, lo cual agrava el problema, porque indica que cepas ambientales también podrían actuar como reservorios de resistencia. Por ello, se hace necesario buscar nuevas estrategias para su control, siendo los bacteriófagos una potencial herramienta biocontroladora. Sin embargo, la adquisición de este tipo de defensa podría tener un costo en el “fitness” celular para algunos casos. En este trabajo, se caracterizaron Pseudomonas ambientales mediante MLSA, las cuales resultaron ser cercanas filogenéticamente puesto que sus similitudes genéticas de distancias fluctúan entre 0,01 y 0,08. Además, no se observó una correlación entre su agrupación genética y el origen de aislamiento. Cabe destacar que el análisis individual del gen cts resultó en los mismos filogrupos. Por otra parte, un 79% de las cepas resultaron resistentes a cobre y estreptomicina. Dos cepas de Pseudomonas susceptibles a fagos generaron variantes resistentes a estos, las cuales se caracterizaron por cambios en su motilidad y tolerancia a cobre. En todas las variantes resistentes a fagos derivadas de la cepa parental denominada T1.9, disminuyó a la mitad el diámetro de colonia promedio alcanzado para el nado en swarming. Para el caso de swimming aumentó entre un 14% y 19%. Todas las variantes resistentes derivadas de la cepa AI_1 no presentaron cambios estadísticamente significativos en ninguno de los dos tipos de nado. En cuanto a la tolerancia a cobre, todas las cepas resistentes a fagos derivadas de T1.9, alcanzaron promedios de DO600 mayores en un 56%, 43,6% y 49,5% que la cepa parental, para una concentración de 3,5 mM de CuSO4 a las 48h. Mientras que para la cepa AI_1 solo hubo diferencias significativas para las variantes resistentes al Fago18, las cuales alcanzaron una DO600 33,5% mayor. Finalmente, este es el primer estudio que reporta cambios en la motilidad y tolerancia a cobre de Pseudomonas ambientales resistentes a cobre y estreptomicina, cuando adquieren resistencia a fagos. Estos cambios dependen tanto de la tendencia de las bacterias a adquirir dicha resistencia como de los mecanismos que utiliza para ello. En este análisis, la cepa T1.9 tendió a adquirir resistencia a tres fagos y presentó cambios significativos de motilidad y tolerancia a cobre. Entonces, utilizar fagos como herramienta de biocontrol de bacterias patógenas podría generar cepas menos o más virulentas.

Chile is distinguished by being an important producer of fruits and vegetables worldwide. Among them, the tomato (Solanum lycopersicum) is one of the most consumed vegetables. However, crops are often susceptible to bacterial diseases, the uncontrolled outbreaks of which mean great economic losses. The presence of Pseudomonas species in the soil or epiphytes in plant tissue has been described, considered innocuous but in certain cases they have shown the ability to opportunistically infect tomato plants. Currently, bacterial diseases are controlled by cultural management and preventive applications of copper agrochemicals and / or antibiotics. The excessive use of these has favored the selection of resistant bacterial strains, leading to a decrease in the effectiveness of these control measures. Furthermore, strains of Pseudomonas resistant to copper and streptomycin have been reported in the field. Which aggravates the problem, because it indicates that environmental strains could also act as reservoirs of resistance. For this reason, it is necessary to search for new strategies for their control, with bacteriophages being a potential biocontroller tool. However, the acquisition of this type of defense could have a cost in the cellular “fitness” for some cases. In this work, environmental Pseudomonas were characterized by MLSA, which turned out to be phylogenetically close since their genetic similarities of distances fluctuate between 0,01 and 0,08. Furthermore, no correlation is found between their genetic grouping and the origin of isolation. It should be noted that individual analysis of the cts gene resulted in the same phylogroups. On the other hand, 79% of the strains were resistant to streptomycin and copper. Two phage-susceptible strains of Pseudomonas generated phage-resistant variants, which were characterized by changes in their motility and tolerance to copper. In all phage resistant variants derived from the parental strain designated T1.9, the average colony diameter achieved for swarming was halved. In the case of swimming, it increased between 14% and 19%. All the resistant variants derived from the AI_1 strain did not show statistically significant changes in either of the two types of swimming. Regarding tolerance to copper, all the phage resistant strains derived from T1.9, reached averages of OD600 higher by 56%, 43.6% and 49.5% than the parental strain, for a concentration of 3,5 mM CuSO4 at 48h. While for the AI_1 strain there were only significant differences for the variants resistant to Fago18, which reached an OD600 33.5% higher. Finally, this is the first study that reports changes in the motility and copper tolerance of environmental Pseudomonas resistant to copper and streptomycin, when they acquire resistance to phages. These changes depend both on the tendency of the bacteria to acquire this resistance and on the mechanisms they use to do so. In this analysis, the T1.9 strain tended to acquire resistance to three phages and showed significant changes in motility and tolerance to copper. Thus, using phages as a biocontrol tool for pathogenic bacteria could generate less or more virulent strains.