Efectos de la co-estimulación con corticoides e IL-6 sobre la expresión y secreción de VEGF A en condrocitos murinos en etapa de diferenciación hipertrófica

Abstract

Resumen: La artritis reumatoidea juvenil (ARJ) es una enfermedad inflamatoria articular autoinmune de alta prevalencia en la niñez y se caracteriza por un aumento de citoquinas proinflamatorias tales como interleuquina-6 (IL-6). Estos pacientes son tratados con fármacos antiinflamatorios, incluyendo los glucocorticoides (GCs). Se ha demostrado que en pacientes con ARJ el proceso de osificación endocondral (OE) puede estar alterado con potenciales consecuencias en el crecimiento del niño. Uno de los factores más importantes en el proceso de OE es el factor de crecimiento vascular endotelial de tipo A (VEGF A), factor que media el proceso de invasión vascular desde la diáfisis osificada hacia los condrocitos hipertróficos (CH) del cartílago de crecimiento Los condrocitos en etapa de diferenciación hipertrófica (CDH) se caracterizan por expresar factores de trascripción como el RUNX 2, generar matriz extracelular rica en colágeno tipo X y secretar factores como el VEGF A. En situaciones de hipoxia este factor es secretado en respuesta a la inducción del factor hipóxico isquémico (HIF 1alfa) mientras que en normoxia RUNX 2 induce a VEGF A de manera directa uniéndose a su promotor y de modo indirecto al impedir la degradación de HIF 1alfa. Se ha descrito que la IL-6 puede aumentar la expresión de VEGF A por mecanismos que involucran a la vía de señalización de STAT3. Por otra parte se ha reportado que los GCs pueden disminuir la expresión de VEGF A al interactuar con los factores de trascripción que lo regulan. Se desconoce si la co-estimulación de GCs más IL-6 a concentraciones encontradas en pacientes con ARJ activa en tratamiento con GCs, modula la expresión y secreción de VEGF A en CDH. Y, de ocurrir esta modulación, tampoco se sabe si RUNX 2 también sufre variaciones de su expresión. El objetivo del presente estudio fue evaluar en un modelo de CDH murino los efectos de dexametasona (Dex) e IL-6, por separado y en combinación, sobre los niveles de expresión del mRNA de VEGF A y de RUNX 2 y sobre la secreción de VEGF A. Para ello, células ATDC5 fueron cultivadas y diferenciadas a CDH. Una vez diferenciadas fueron tratadas con Dex 10-8 molar (M) e IL-6 120pg/ml, por separado y en combinación por 3 horas. Se extrajo el RNA total y se evaluaron los niveles de expresión del mRNA de VEGF A y RUNX 2 por medio de PCR tiempo real. Se almacenó el sobrenadante y se evaluó la cantidad de proteína de VEGF A secretada por medio de un ELISA. Se observó que (i) Dex disminuyó significativamente los niveles de expresión del mRNA de VEGF A y RUNX 2 en CDH murinos; (ii) IL-6 indujo un aumento significativo en los niveles de expresión del mRNA de VEGF A, pero no produjo cambios significativos en los niveles de expresión del mRNA RUNX 2 y que (iii) la combinación de Dex más IL-6 no producen cambios en los niveles de expresión del mRNA de VEGF A ni de RUNX 2. En relación a la secreción de VEGF A se observó que (i) Dex disminuyó significativamente los niveles de proteína secretada; (ii) IL-6 produjo un aumento significativo mientras que (iii) la combinación de Dex más IL-6 no produjo cambios en los niveles de proteína secretada. Con estos resultados podemos concluir que Dex a concentraciones similares a las conseguidas por dosis farmacológicas utilizadas en la terapia de pacientes con crisis aguda de ARJ, disminuye los niveles de expresión del mRNA de VEGF A y de RUNX 2 así como de la proteína VEGF A secretada. Por otra parte, Dex en combinación con IL-6 no modifica los niveles de expresión del mRNA de VEGF A y de RUNX 2 así como tampoco modifica los niveles de VEGF A secretado.

Abstract: Juvenile rheumatoid arthritis (JRA) is an autoimmune inflammatory joint disease highly prevalent in childhood. This condition is characterized by increase of proinflammatory cytokines such as interleukin 6 (IL-6). These patients are treated with a mixture of anti inflammatory drugs including glucocorticoids (GCs). It has been shown that in patients with JRA the process of endochondral ossification (OE) can be altered, with potential consequences for the child's growth. One of the most important factors in the process of OE is the vascular endothelial growth factor A (VEGF A), the VEGF A mediates the process of vascular invasion from ossified shaft to hypertrophic chondrocytes (CH) growth plate. Hypertrophic chondrocyte differentiation stage (CDH) are characterized by expressing transcription factors such as RUNX 2, produce extracellular matrix rich in type X collagen and secrete factors such as VEGF A in hypoxia . The VEGF A is secreted in response to hypoxic ischemic induction factor (HIF 1alpha) while in normoxia RUNX 2 induces VEGF A indirectly by preventing the degradation of HIF 1alpha. It described that IL-6, can increase the expression of VEGF A by mechanisms involving the STAT3 signaling pathway. Furthermore it has been reported that GCs can decrease the expression of VEGF A to interact with transcription factors that regulate it. It is unknown whether costimulation GCs more IL-6 concentrations found in patients with active JRA treated with GCs, modulates the expression and secretion of VEGF-A in CDH. And, this modulation occur, assess whether RUNX also suffers variations expression. The aim of this study is to evaluate the effects of dexamethasone (Dex) and IL-6, separately and in combination, on the levels of VEGF mRNA and RUNX A 2 and on the secretion of VEGF A, a model of CDH murine. ATDC5 cells were cultured and differentiated stage of CDH. Once differentiated Dex were treated with 8.10 molar (M) and IL-6 120pg / ml, separately and in combination for 3 hours. Total RNA was extracted and mRNA levels of VEGF A and RUNX 2 were evaluated by real time PCR. The supernatant was stored and the secreted VEGF A protein was evaluated by an ELISA kit. Dex was observed that significantly decreased mRNA levels of VEGF A and RUNX 2 in CDH murine. IL-6 induced a significant increase levels of VEGF A mRNA, but no significant changes in RUNX 2 mRNA levels. The combination of IL-6 plus Dex not result in changes in mRNA levels of VEGF A or RUNX 2. In evaluating VEGF secretion A it shows that Dex significantly decreased levels of secreted protein. In turn, IL-6 produce a significant increase while the combination of Dex more IL-6 produced no change in the levels of secreted protein. With these results we can conclude that Dex similar to those achieved by pharmacological doses used in therapy of patients with JRA acute crisis levels, reduces the levels of VEGF A mRNA and RUNX 2 and VEGF A protein secreted. Moreover, Dex in combination with IL-6 does not alter the levels of VEGF A mRNA and RUNX 2 and teh conbination does not alter the levels of secreted VEGF A protein.