Significado metabólico - funcional del receptor PPAR-y y FOXO1 en células de granulosa de pacientes con síndrome de ovario poliquístico

Abstract

El síndrome de ovario poliquístico (SOP) es una de las alteraciones endocrino metabólicas más comunes en la edad fértil. Un 50-70% de las pacientes presentan hiperinsulinemia y resistencia a la insulina (IR). En adipocitos y células musculares de pacientes SOP y RI se ha encontrado una menor incorporación de glucosa bajo estímulo de insulina, con una disminución en la expresión de los transportadores de glucosa, en particular GLUT 4, se ha planteado que la IR presente en estos tejidos se relaciona con defectos en la fosforilación de IRS-1/2, disminución en la activación de PI3-K/Akt y alteración en los patrones de expresión de IRS-1/2. Además se ha establecido que los factores de transcripción FoxO1 y PPARγ son claves en la regulación del metabolismo de la glucosa y la respuesta a insulina. Rosiglitazona (Rz), es un potente agonista, selectivo de los receptores PPARγ, regulando la expresión de genes participantes en el metabolismo de lípidos y glucosa. Evidencia actual ha mostrado que las glitazonas incrementan la incorporación de glucosa dependiente de insulina en cultivos de miocitos y adipocitos, modulando la expresión de GLUT4. La información en relación al papel que juegan FoxO1 y PPARγ en la vía de señalización de insulina en células de la granulosa (CG) de pacientes con SOP es prácticamente inexistente. Así como el efecto de la administración de agonistas farmacológicos de PPARγ sobre la vía de señalización de insulina y estos factores transcripcionales. El objetivo de esta tesis es estudiar in vitro la vía de señalización de insulina, rol de PPARγ y FoxO1, y así como la del agonista de PPARγ Rosiglitazona en la vía metabólica de insulina en CG de pacientes SOP (Tipo NIH). Para este fin se realizaron estudios in vitro de CG de mujeres con función ovárica normal y SOP, en presencia o ausencia de insulina 100 ng/ml y preincubadas con Rz. Se determinaron los niveles proteicos y de mRNA de GLUT4 por Western blot (WB) y qRT-PCR, respectivamente. La vía metabólica de señalización de insulina se evaluó a través de la expresión de IRS 1, Akt y sus formas fosforiladas por WB. FoxO1 y PPARγ se estudiaron con WB e inmunofluorescencia .Además se realizó un estudio funcional de incorporación de glucosa tritiada bajo el estímulo de insulina en CG pre incubadas o no con Rz. Nuestros resultados demuestran que las CGSOP expresan menores niveles de Glucotransportadores 1 y 4, con una menos incorporación de glucosa bajo el estimulo de insulina al compararlas con el grupo control. No se encontraron diferencias en los niveles proteicos de IRS- 1 entre los dos grupos de estudio, pero las CGSOP presentan niveles de p IRS1 Ser 312, significativamente mayores que las CG control, con menor expresión de AKT y p AKT al compararlas con CG control. PPAR γ se encuentra disminuido en CGSOP, mientras de FOXO1 esta aumentado, pero con menores niveles de p FOXO1 que las CG control. La preincubacion con Rosiglitazona 0,1 μM aumenta la incorporación de glucosa en las CGSOP, con una aumento en los niveles de GLUT4 y una mejora en la via de señalización de insulina, disminuyendo p IRS1 Ser 312 y FOXO1, aumentando los niveles de AKT, p AKT , PPARγ y p FOXO1 Esto resultados demuestran que CGs SOP presentan un perfil metabólico y molecular diferente a CGs de mujeres con función ovárica normal, que las alteraciones moleculares de la vía metabólica IRS1/Akt son similares a las descritas en tejidos insulino resistentes clásicos. Esta disfunción metabólica podría contribuir con la alteración en el desarrollo folicular de la paciente SOP. La activación in vitro de PPAR γ a través de Rosiglitazona aumenta la expresión de GLUT4 en CG SOP , además modula la vía de señalización del receptor de insulina-IRS1-Akt en células de la granulosa de SOP mejorando la insulino resistencia de estas células El incremento del transporte de glucosa en las células de la granulosa de las pacientes SOP, podría mejorar la competencia metabólica de los ovocitos en maduración, contribuyendo con esto a una mejor calidad ovocitaria en este grupo de pacientes.

Polycystic ovary syndrome ( PCOS) is one of the most common endocrine metabolic disorders in reproductive age . 50-70% of patients develop hyperinsulinemia and insulin resistance (IR). Adipocytes and muscle cells of PCOS patients and IR shows lower glucose uptake under insulin stimulation , with a decrease in the expression of glucose transporter , particularly GLUT4 , and defects in the phosphorylation of IRS 1/2 , decreased activation of PI3-K/Akt and altered patterns of expression of IRS 1/2 . It has also established that transcription factors as FoxO1 and PPARy receptors are key factors in the regulation of glucose metabolism and insulin response. Rosiglitazone (Rz), is a potent selective agonist for the PPARy receptors, regulating the expression of genes involved in lipid and glucose metabolism. Current evidence has shown that glitazones increase the of insulin dependent glucose uptake in cultured myocytes and adipocytes and modulate the expression of GLUT4 . The information relating to the role and PPARy FoxO1 in insulin signaling pathway in granulosa cells (GC) in patients with PCOS is virtually nonexistent. And the effect of the administration of pharmacological PPARy agonists on insulin signaling pathway and these transcription factorsis unknow . The objective of this thesis was to study in vitro the insulin signaling pathway, the role of PPARy and FoxO1 and the PPARy agonist rosiglitazone on insulin pathway in GG from PCOS patients (NIH type). For this purpose, in vitro studies in GCs from normal ovarian function women and PCOS patient, in presence or absence of insulin 100 ng/ml and preincubated with Rz were performed . Protein and GLUT4 mRNA levels were determined by Western blot (WB) and qRT- PCR respectively. The metabolic pathway of insulin signaling was assessed through expression of IRS1, Akt and its phosphorylated forms by WB. FoxO1 and PPARy were studied with WB and immunofluorescence . A functional study of tritiated glucose uptake under insulin stimulation pre CG Rz incubated or not was performed . Our results show that PCOS GCs express lower levels Glucotransportadores 1 and 4, with less glucose uptake under insulin stimulation when compared with the control group. No differences in the protein levels of IRS-1 between the two study groups were found, but the levels of p IRS1 Ser 312, was significantly higher in PCOS GCs than in the Control GCs with lower expression of AKT and pAKT when compared with control. PPAR γ is decreased PCOS GCs while FOXO1 is increased, but with lower levels of p FOXO1 than in the Control GCS. The pre-incubation with 0.1 μM Rosiglitazone increases glucose uptake in the PCOS GCs, with increased levels of GLUT4 and improved insulin signaling via decreasing pIRS1 Ser312,FOXO1 and increasing levels of AKT ,pAKT, pFOXO1 and PPARy. This results show that PCOS GCs have a different metabolic and molecular profile compare with GCs of women with normal ovarian function, the molecular alterations in the metabolic pathway IRS1/Akt are similar to those described in classical insulin -resistant tissues. This metabolic dysfunction may contribute to altered follicular development in PCOS patient. The in vitro activation of PPAR γ through Rosiglitazone increases GLUT4 expression and modulates the signaling pathway - IRS1 insulin receptor -Akt in granulosa cells from PCOS, improving insulin resistance of these cells. Increased glucose transport in granulosa cells of PCOS patients could improve the metabolic competence of maturing oocytes, this contributing to a better egg quality in this group of patients