Evolución del mecanismo de intercambio de segmentos en la subfamilia FoxP de factores de transcripción humanos

Abstract

Las proteínas Fox son una familia de factores de transcripción cuyo dominio de unión a ADN existe canónicamente como monómeros en solución. Sin embargo, las estructuras de FoxP2 y FoxP3, dos proteínas que son miembros de la subfamilia FoxP (FoxP1-4), las muestran como proteínas que dimerizan por intercambio de segmentos (DS). El DS es un mecanismo donde elementos idénticos de estructura secundaria forman dímeros estabilizándose por interacciones intermoleculares. Para determinar si los cambios de secuencia y estructura, observados en la subfamilia FoxP, pueden haber determinado la capacidad de dimerizar por este mecanismo, en el contexto de una familia monomérica, se realizó un análisis experimental y computacional de estas proteínas. Experimentos de cinética de disociación del dímero de FoxP4, indican que tiene una afinidad intermedia de sus monómeros con una constante de disociación (KD) de 135 μM ±8.0 μM a 33 ºC, respecto a los valores de KD reportados para FoxP1 (~μM), FoxP2 (~ mM) y a FoxP3 que es considerada como un dímero obligado. La comparación de FoxP4 con FoxP1 determinó que la barrera cinética entre FoxP1 y FoxP4, está principalmente explicada por una gran barrera entálpica de activación para la asociación de los monómeros, sugiriendo que las diferencias entre estas proteínas afectan los contactos entre los residuos que las conforman, definiendo por lo tanto su capacidad de dimerizar. Además, se obtuvo la primera estructura para FoxP4, que la muestra como un monómero a una resolución de 2.2 Å en ausencia de ADN; la comparación estructural con el resto de los monómeros de FoxP1 y FoxP2 muestran que los monómeros tienen una alta similitud estructural. Para completar la caracterización biofísica, se realizaron experimentos de desplegamiento al equilibrio, seguidos por dicroísmo circular, a una concentración de proteína de 20 μM para todas las proteínas FoxP. Los resultados mostraron que FoxP3 y FoxP1 tienen un mecanismo de desplegamiento de tres estados (N2  2I  2U) con la acumulación de un intermediario monomérico (I) que retiene un ~80% del contenido de estructura secundaria de la proteína. De acuerdo con la concentración de proteína usada, que en FoxP2 y FoxP4 favorece el monómero, ambas proteínas siguieron un mecanismo de desplegamiento de dos estados (N2  2U). Esos datos sugieren que las propiedades de dimerización están relacionadas con la presencia del intermediario monomérico. Se evaluó la dinámica conformacional de la subfamilia FoxP con dinámicas moleculares convencionales utilizando las estructuras disponibles para los monómeros (FoxP1, FoxP2, FoxP4) y los dímeros (FoxP2 y FoxP3). Las simulaciones moleculares de los monómeros FoxP1 y FoxP4 y no las de FoxP2, mostraron movimientos concertados entre residuos del lazo entre H3-S2 y la hélice H1, lo que está de acuerdo antecedentes de simulaciones de plegamiento que indican que esa vía de comunicación (H3-S2 y H1) es clave para la formación del estado de transición monomérico. Adicionalmente, durante las simulaciones moleculares de los dímeros de FoxP2 y FoxP3 se observa que solamente en FoxP3 se mantiene estable una interfaz secundaria entre las hélices H1 de ambas subunidades. De acuerdo con lo anterior, en FoxP1, que carece de esa interfaz, las simulaciones moleculares de plegamiento, utilizando modelos basados en estructura, muestran que la vía de disociación del dímero conecta al dímero nativo con dos ensambles conformacionales (I1 e I2) los que proveen en parte una explicación estructural de los intermediarios reportados utilizando FRET de molécula única. Estudios filogenéticos de la familia Fox muestran que el intercambio de segmentos se origina con el ancestro de la subfamilia FoxP (AncP) y se relaciona a la mutación P39A en la región de la bisagra. Sin embargo, antes de que esta mutación se originara, ocurrieron otros cambios en la historia evolutiva de la familia que, secundariamente modulan el intercambio de segmentos: el estado de protonación de H59 modula el intercambio de segmentos según simulaciones moleculares de FoxP1 y el reemplazo de F7 (conservada en todas las proteínas FoxP) por leucina, aumenta la constante de disociación de FoxP1 24 veces. Finalmente, el árbol filogenético de la familia muestra a las proteínas FoxP divergiendo en dos ramas: una con el dímero obligado FoxP3 y otra que agrupa a FoxP1, FoxP2 y FoxP4, lo que está de acuerdo con sus propiedades de dimerización. Estos resultados sugieren que el intercambio de segmentos surgió en esta familia desestabilizando el monómero típico de la familia Fox y favoreciendo la formación de un intermediario monomérico que está estrechamente relacionado con la capacidad de dimerizar de estas proteínas, como también de su dinámica conformacional

The forkhead box (Fox) proteins are a widespread family of transcription factors whose DNA–binding domain exists canonically as a monomer in solution. Nevertheless, structures of FoxP2 and FoxP3, which are members of the P subfamily (FoxP1–4), showed dimeric structures via three–dimensional domain swapping (DS), a mechanism where the exchange of identical segments between subunits leads to intertwined dimers, stabilized by intermolecular interactions. To determine if small sequence and structure changes observed across this family may have differentially sculpted the dimerization ability, an experimental and computational analysis was performed. Kinetic dissociation experiments of FoxP4 dimer indicated that this protein represents an intermediate affinity between monomers, with a dissociation constant (KD) of 135 μM ±8.0 μM at 33 ºC, with respect to the values reported for FoxP1 ((~μM), FoxP2 (~mM) and FoxP3 considered an obligated dimer. The comparison of FoxP4 with FoxP1 showed that the kinetic barriers between them are mainly explained due to the large enthalpic barrier of association of FoxP4 monomers, suggesting that the specific evolutionary differences affect residue contacts and therefore the dimerization ability of these proteins. The first crystal structure of monomeric FoxP4 at 2.2 Å in absence of DNA was obtained, the structural comparison along with FoxP monomers showed high structural conservation with FoxP1 and FoxP2 monomeric structures. To complete the biophysical characterization, equilibrium unfolding experiments followed by circular dichroism were performed at the same protein concentration for all FoxP proteins (20 uM). Results showed that FoxP3 and FoxP1 followed a three-state mechanism (N2  2I  2U) with the accumulation of the monomeric intermediate (I) which retains ~80% of the overall structural content (80%). According to the protein concentration used in the experiments, which favors the monomer of FoxP2 and FoxP4, both proteins followed a two-state folding mechanism (N U). All these data strongly suggest that the dimerization properties are related to the presence of a monomeric intermediary. To gain insights about FoxP conformational dynamics, molecular dynamics simulations of the available FoxP monomeric (FoxP1, FoxP2, FoxP4) and dimeric (FoxP2, FoxP3) structures were performed. In line with previously reported experimental and folding molecular dynamics studies, conventional simulations of FoxP monomers reveal correlated movement between residues located in a H3-S2 loop and H1 helix in FoxP1 and FoxP4, but not in FoxP2. Additionally, FoxP3 and FoxP2 dimer simulations show that the secondary interface between H1 helices of the FoxP3 dimer allows retaining the compact conformation of this protein. In agreement with the absence of the H1-H1 secondary interface, FoxP1 dimeric folding simulations using structure-based models shows that the dissociation pathway has locally disordered intermediaries (I1 and I2) which provide a structural description of experimental intermediaries observed by reported studies of single-molecule FRET. Altogether these results suggest that during evolution, conformational dynamics have a direct impact on native structure dynamics and trigger local unfolding events. Phylogenetic studies of Fox family members show that the origin of domain swapping in the ancestor (AncP) is related to key mutation P39A in the hinge region of Fox proteins. However, before the origin of this mutation, other sequence changes emerged, as in the case of H59, which offers chemical control of the amino terminal of H3 helix depending on its protonation state, as molecular simulations dynamics simulations suggest. Also, replacement of a strictly conserved amino acid of FoxP proteins, F7, by leucine, observed in monomeric proteins, increases KD over 24-fold. Interestingly, protonation of H59 or the F7L mutation in FoxP1 affects dimerization by increasing the kinetic barrier between the monomer and the transition state of association. Finally, the phylogenetic tree shows an exclusive branch emerging from AncP for the obligated dimer, FoxP3, and a second branch grouping FoxP1, FoxP4, and FoxP2, the FoxP members with reduced dimerization propensity. Altogether these results suggest that DS in the Fox family emerged by monomer destabilization allowing the emergence of a monomeric intermediary, which directly impacts the dimerization propensity of these proteins and that the evolutionary sequences changes along FoxP members modeled its conformational dynamics and dimerization propensities