Papel del receptor soluble de Interleuquina-6 en el cambio fenotípico de las células musculares lisas vasculares

Abstract

La práctica regular de ejercicio tiene muchos efectos positivos en la salud física y mental de las personas. Durante el último tiempo, apareció como una beneficiosa estrategia en la prevención y disminución de factores de riesgo para muchas enfermedades, como las enfermedades cardiovasculares (ECV). A su vez, el desarrollo y progresión de las ECV se asocia a cambios estructurales y funcionales en la vasculatura. En condiciones normales, la vasculatura contiene células musculares lisas vasculares (CMLV) en estado mayoritariamente diferenciado. Estas células son responsables de la regulación de la contracción y relajación de las arterias, controlando la presión y el flujo sanguíneo. En condiciones patológicas, estas células se desdiferencian desde un estado contráctil, a un estado sintético y proliferativo/migratorio. En el estado desdiferenciado, disminuyen su contenido de proteínas contráctiles, secretan proteínas de la matriz extracelular, y aumentan su capacidad proliferativa/migratoria, moviéndose desde la capa media a la intima de la arteria. Cuando la cantidad de CMLV desdiferenciadas aumenta, se produce un remodelado vascular patológico, un evento relacionado negativamente con la salud vascular. Sin embargo, atletas con alta frecuencia de entrenamiento también pueden presentar un tipo de remodelado vascular conocido como fisiológico. En este remodelado se producen cambios estructurales como un mecanismo de adaptación a la alta demanda de oxígeno y nutrientes; caracterizado por un aumento del diámetro de la arteria, en ausencia de inflamación y fibrosis. Por otra parte, el ejercicio físico incrementa los niveles circulantes de IL‐6, una citoquina ampliamente conocida por sus acciones inflamatorias en las respuestas inmunes del organismo. Sin embargo, al liberarse durante una condición fisiológica como el ejercicio, se comporta como una mioquina e influencia el metabolismo energético a través de la activación de AMPK. Ambas acciones antagónicas de IL‐6 se pueden explicar por la presencia de una forma soluble del receptor de IL‐6 (sIL6‐R). Además, el ejercicio físico también incrementa los niveles plasmáticos de sIL‐6R. sIL‐6R permite ampliar el espectro de células que responden a IL‐6, particularmente aquellas células que no expresan el IL‐6R en la membrana plasmática. Así, la vía de señalización descrita para sIL‐6R es conocida como trans‐señalización e implica la formación de un complejo IL‐6/sIL‐6R que se une a una glicoproteína de membrana, gp130, activándola. Sin embargo, los efectos de la trans‐señalización son poco entendidos y aún requieren mayor investigación. En el presente trabajo, nos propusimos determinar los efectos de la trans‐señalización en el cambio fenotípico de las CMLV, con el objetivo de entender el mecanismo por el cual los atletas presentan un remodelado vascular fisiológico. Además, también incluimos evaluar los efectos de la trans‐señalización en la activación de AMPK, con el fin de entender las vías de señalización que participan en la acción de sIL‐6R. Como hipótesis planteamos que “El receptor soluble de interleuquina‐6 (sIL‐6R) previene la disminución de las proteínas contráctiles, síntesis de colágeno, migración y proliferación de las células musculares lisas vasculares (CMLV) inducidas por interleuquina‐6 (IL‐ 6), a través de un mecanismo dependiente de la activación de la quinasa activada por AMP (AMPK)”. Los objetivos específicos fueron: (1) Evaluar el efecto de IL‐6 en los niveles de proteínas contráctiles, síntesis de colágeno, migración y proliferación de las CMLV A7r5; (2) Evaluar el efecto de sIL‐6R en los niveles de proteínas contráctiles, síntesis de colágeno, migración y proliferación de las CMLV A7r5 inducidas por IL‐6; (3) Evaluar el papel de AMPK en los efectos de sIL‐6R en las CMLV A7r5. Todos los experimentos se realizaron en la línea celular de CMLV embrionaria de rata, A7r5. Los niveles de las proteínas contráctiles, α‐actina de músculo liso (α‐SMA), calponina y proteína de músculo liso 22 (SM22), se evaluaron por Western blot. La migración se determinó por el ensayo de cierre de heridas, niveles fosforilados de la quinasa de adhesiones focales (FAK) en la Tyr397, y por transwell. La proliferación celular se evaluó midiendo los niveles de ciclina D por Western blot, y a través del ensayo de reducción de formazán (MTT). La síntesis de matriz extracelular se evaluó a través de los niveles de colágeno I por Western blot. Por último, la activación de AMPK se determinó a través de sus niveles de fosforilación en la Thr172, y los niveles proteicos de PGC1‐α, un blanco río abajo. El tratamiento de las CMLV A7r5 con IL‐6, sIL‐6R, o la combinación de estas dos proteínas no modificó el contenido de proteínas contráctiles α‐SMA, calponina y SM22; ni los niveles proteicos de colágeno I. Tampoco se alteró la proliferación de las CMLV A7r5. Como control positivo de desdiferenciación se utilizó el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF‐BB). Las células estimuladas con PDGF‐BB al tratarse con sIL‐6R no cambiaron los niveles de proteínas contráctiles, síntesis de colágeno o la proliferación inducida por PDGFBB. Sin embargo, el tratamiento con IL‐6 o PDGF‐BB incrementó la migración de las CMLV A7r5. Interesantemente, la adición de sIL‐6R disminuyó la migración celular inducida por IL‐6 o por PDFG‐BB. En este sentido, la adición de sIL‐6R disminuyó la fosforilación de FAK, aún en las menores dosis de sIL‐6R ensayadas. Por otra parte, el tratamiento de las células con sIL‐6R incrementó los niveles de fosforilación de AMPK. Sin embargo, no se detectaron cambios en los niveles proteicos de PGC1‐α. Por ultimo, la adición de un inhibidor de AMPK, compuesto C, reprodujo los efectos anti‐migratorios obtenidos con sIL‐6R en CMLV A7r5 estimuladas con PDGF‐BB. Así, la trans‐señalización de IL‐6 aparece como un mecanismo importante de regulación del fenotipo migratorio de las CMLV, y podría explicar, al menos en parte, el mecanismo por cual el ejercicio físico mantendría la salud vascular de los atletas

Regular exercise has many positive effects on physical and mental health. For quite a time indeed, it has emerged as a beneficial useful strategy in the prevention and reduction of risk factors for many diseases, such as cardiovascular disease (CVD). In turn, the development and progression of CVD are associated with structural and functional changes in the vasculature. Under normal conditions, the vasculature contains vascular smooth muscle cells (VSMCs) in mostly a differentiated state; specializing their functions in the regulation of artery contraction and relaxation; regulating pressure and blood flow. Under pathological conditions, these cells change their contractile state to a synthetic and proliferative/migratory state. In the un‐differentiated state, these cells decrease the content of contractile proteins, secrete extracellular matrix proteins, and increase their proliferative and migration capacity, allowing the movement of VSMC from the tunica media to the intima layer of arteries. When the synthetic and proliferative/migratory VSMC phenotype occurs, pathological vascular remodeling is triggered, impairing vascular health. However, athletes with high training frequency can also present a physiological vascular remodeling, where structural changes take place as a mechanism of adaptation to the high demand for oxygen and nutrients; and which it is characterized by increasing the diameter of the artery, but in the absence of inflammation and fibrosis. The physical exercise increases circulating levels of IL‐6, a cytokine widely known for its inflammatory actions in the immune response. However, during a physiological condition such as exercise, it behaves as a myokine and influence energy metabolism through the activation of AMPK. Both antagonist actions of IL‐6 can be explained by the production of soluble version of the IL‐6 receptor, sIL‐6R. The action of sIL‐6R allows to broaden the spectrum of cells that respond to IL‐6, particularly in cells that do not express the membrane bound IL‐6R. Thus, the signaling pathway described for sIL‐6R is known as trans‐signaling and involves the formation of an IL‐6/sIL‐6R complex that binds and activates a membrane glycoprotein, gp130. However, the effects of trans‐signaling are poorly understood and still require further investigation. In the present work, we determined the effects of trans‐signaling on phenotypic change of VSMCs, with the objective to understand the mechanism by which athletes exhibit physiological vascular remodeling. In addition, we also evaluated the effects of trans‐signaling on energy metabolism through AMPK activation, to understand the signaling involved in the action of sIL‐6R. Thus, we propose that “Soluble interleukin‐6 receptor (sIL‐6R) prevents the decrease in contractile proteins, collagen I content, migration, and proliferation of vascular smooth muscle cells (VMSCs) induced by interleukin‐6 (IL‐6), though the activation of an AMP‐activated kinase (AMPK) dependent mechanism”. The specific objectives were: (1) To evaluate the effect of IL‐6 in the dedifferentiation of A7r5 VSMCs. (2) To evaluate the effect of sIL‐6R on the dedifferentiation of A7r5 VMSCs induced by IL‐6. (3) To evaluate the role of AMPK in the effects of sIL‐6R on A7r5 VMSCs. All experiments were performed on the CMLV A7r5 cell line. Contractile protein, α‐smooth muscle actin (α‐SMA), calponin and smooth muscle protein 22 (SM22), levels were evaluated by Western blot. Migration was determined by the wound closure assay, phosphorylated levels in Tyr397 of focal adhesion kinase (FAK), and by transwell. Cell proliferation was evaluated by measuring cyclin D levels by Western blot, and by the formazan reduction assay (MTT). Extracellular matrix synthesis was evaluated by the levels of collagen I by Western blot. Finally, AMPK activation was assessed by Thr172 phosphorylation levels, and PGC1‐α protein levels, a downstream target. The treatment with of IL‐6, sIL‐6R, or the combination of both proteins did not alter the contractile protein levels, collagen I content, and proliferation of VSMC A7r5. Platelet‐derived growth factor (PDGF‐BB) was used as a positive dedifferentiation control. VMSCs dedifferentiated with PDGF‐BB when were treated with sIL‐6R did not change the contractile protein levels, collagen synthesis or proliferation induced by PDGF‐BB. However, the treatment with IL‐6 or PDGF‐BB increased VSMC A7r5 migration. Interestingly, the addition of sIL‐6R decreased the migration induced by IL‐6 or PDFG‐BB. In this sense, the addition of sIL‐6R decreased FAK phosphorylation in a dose‐dependent manner. Additionally, the treatment of cells with sIL‐6R increased AMPK phosphorylation levels. However, no changes were detected in PGC1‐α protein levels. Finally, the addition of an AMPK inhibitor, compound C, reproduced the anti‐migratory effects obtained with sIL‐6R in PDGF‐BB treated VSMC A7r5. Thus, IL‐6 trans‐signaling appears as an important mechanism to protect the functional status of VSMCs, and could explain, at least in part, the mechanism by which physical exercise would maintain the vascular health of athletes