Rol funcional de los dominios sensores de voltaje I y III de CaV1.1 sobre las corrientes de Ca2+ tipo L y los transitorios de Ca2+ en fibras musculares adultas de ratón

Abstract

El canal de Ca2+ tipo L CaV1.1 es un canal iónico gatillado por voltaje, que se expresa principalmente en músculo esquelético y su función más estudiada es la relativa a su participación en el proceso de excitación-contracción muscular. Su funcionamiento se basa en el cambio conformacional que sufre ante cambios en el potencial de membrana, de forma similar a lo que ocurre con otros canales gatillados por voltaje, como los canales de K+, con los que comparte algunas características. A diferencia de los canales de K+ gatillados por voltaje, la subunidad α1 de CaV1.1 es un heterotetrámero formado por cuatro dominios (I - IV) denominados dominios sensores de voltaje. Se postula que aminoácidos con carga positiva ubicados en estos dominios, en particular en los segmentos S4 de cada dominio, serían los responsables de los cambios conformacionales que sufre el canal ante las variaciones en el potencial de membrana, no obstante, a la fecha se desconoce cómo estos dominios participan ya sea de manera individual o en conjunto en los procesos en los que está involucrado CaV1.1. Es por esto, que resulta relevante dilucidar los mecanismos por los cuales el canal CaV1.1 es capaz de responder a estímulos despolarizantes que terminarán en contracción muscular, apertura del poro del canal y expresión diferenciada de genes entre otras consecuencias de su activación. En este estudio se realizó el análisis funcional de los dominios sensores de voltaje I y III de la subunidad α1s del canal CaV1.1 de manera individual, utilizando un modelo de expresión de proteínas transgénicas mediante la técnica de electroporación de musculo esquelético in vivo en ratón C57BL/6 (músculo flexor corto de los dedos (FDB)), transfectando un plasmidio con la secuencia que codifica para la subunidad α1s con un reemplazo de los aminoácidos que se postulan como responsables de la sensibilidad a cambios en el potencial de membrana, de los dominios sensores de voltaje I y III, reemplazándolos por glutaminas. Se realizó el análisis funcional mediante la medición y registro de corrientes de Ca2+ tipo L y la liberación intracelular transitoria de Ca2+ utilizando la técnica del voltage clamp con aislación por silicona asociada a microscopia de fluorescencia. Los resultados muestran un aumento significativo en la amplitud de la corriente de Ca2+ para la condición mVSDIII en el pulso a potencial 20mV en comparación al control que expresa la variante WT de la subunidad α1s (p<0,05). Mientras que la neutralización de cargas en el S4 del VSDI no tendría impacto en la amplitud de la corriente observada. El análisis de los datos de la dependencia de voltaje de la corriente mediante un ajuste a una función de Boltzmann muestra una conductancia máxima significativamente mayor en la condición mVSDIII (p<0,05). Para la liberación transitoria de Ca2+, se observa que la condición mVSDI tiende a presentar valores ligeramente mayores a la condición control, sin embargo, estas diferencias no alcanzan significancia estadística. Con estos antecedentes podemos sugerir que el método de expresión de proteínas transgénicas es útil para estudiar la función del canal de Ca2+ CaV1.1. En cuanto a las mutaciones estudiadas, la neutralización de cargas en el segmento S4 del VSDIII genera un aumento significativo en la conductancia de Ca2+ a través del canal (p<0,05), lo que podría sugerir un rol limitador de la corriente para este dominio, o que tal vez la neutralización de cargas en el segmento S4 produce cambios en la estructura tridimensional del poro, aumentando su tamaño, disminuyendo la resistencia y con ello aumentando su conductancia, pese a ello, este dominio no tendría participación en la liberación de Ca2+ desde el retículo, por lo que el vínculo funcional entre CaV1.1 y RYR1 no sería dependiente de los cambios conformacionales derivados del movimiento del segmento S4 del VSD III. La neutralización de cargas en el segmento S4 del VSDI no tendría impacto sobre los procesos estudiados al no encontrar diferencias significativas entre los resultados obtenidos comparado a la condición control. Se hace necesario complementar estos resultados con futuras investigaciones en un modelo similar o en cultivos de miotubos que carecen del gen para CaV1.1, pudiendo agregar el análisis de la participación de los VSDII y VSDIV.

The L type Ca2+ channel CaV1.1 is a voltage-gated channel, mainly expressed in skeletal muscle, where its most studied function is the one related to its participation in the excitation-contraction coupling. Its functioning depends on conformational changes that occur in response to variations in membrane potential, similarly to other voltage-gated channels like K+ channels, conversely to K+ channels, the alpha subunit of CaV1.1 is a heterotetramer composed by four domains (I - IV), named voltage-sensing domains (VSD). Positive charged amino-acids located in these domains, mainly those located in S4 segment of each VSD, are postulated to be responsible of conformational changes in the CaV1.1 structure in response to changes in membrane potential, however, is not well known to date, how these domains participates individually or in group in the different process that CaV1.1 participate. It is important to clarify the mechanism by CaV1.1 is responding to depolarizing stimulus that can end in muscle contraction, different gene expression, and other consequences of its activation. This study analyzed the function of the voltage-sensing domains (VSDs) I and III, of α1s subunit of CaV1.1 individually, using a model of transgenic protein expression, using in vivo muscle electroporation of flexor digitorium brevis (FDB) of C57BL/6 male mice. Transfecting the CaV1.1 gene with a change in the amino acids that are thought to be responsible for sensing changes in the membrane potential of VSD I and III of a1s subunit, replacing it by glutamines. The functional analysis was performed through the measurement and registration of L type calcium currents and the calcium transients release with whole-cell voltage-clamp with silicone gap technique and fluorescent microscopy. Results show an increase in the Ca2+ current amplitude in mVSDIII mutant, at pulse 20mV against control WT α1s (p<0,05). Charge neutralization in S4 segment of VSDI did not affect the current amplitude. analyzing the voltage dependence of the current through Boltzmann function fitting shows a significative higher current conductance in mVSDIII mutant than in control (p<0,05). Depolarization induced Ca2+ release is slightly higher in mVSDI transfected fibers, but data did not reach statistical significance. With these results, we can suggest that the transgenic protein expression method is useful to study the function of CaV1.1 Ca2+ channel. The neutralization of charged amino-acids in the S4 segment of VSDIII produces an increase in the maximum conductance of Ca2+ through this channel (p<0,05), this might suggest a current limiting role for this domain, or that perhaps the neutralization of charges in the S4 segment produces changes in the three-dimensional structure of the pore, increasing its size, decreasing resistance and then, increasing its conductance. Despite it, this domain would not have participation in the transient Ca2+ release, so the functional link between CaV1.1 and RYR1 does not depend on conformational changes derived from the movement of VSD III S4 segment. The neutralization of charges in the S4 segment in VSDI have no impact on the studied processes, as no significant differences were found between the results of mutated versus control condition. It is necessary to complement these results with further research in this model or others, like myotubes cultures without CaV1.1 gene, maybe adding the analysis of the role of VSDII and VSDIV.