Estudio in vitro del efecto anti-fibrogénico cardiaco de angiotensina-(1-9) y su retro-enantiómero

Abstract

Introducción: Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son las principales causas de muerte en Chile y en el mundo, a expensas de patologías como el infarto del miocardio (IM). Durante el remodelado cardiaco, la zona infartada se puebla de abundantes fibroblastos cardiacos (FC) y uno de los factores clave en dicho proceso es el TGF-β1, el cual se induce y activa en el remodelado cardiaco y promueve la fibrosis. Por otro lado, la génesis y desarrollo de varias ECV se asocian con una activación crónica del sistema renina-angiotensina. Este sistema desempeña un papel importante en el control de la presión arterial, y su activación excesiva se asocia con fibrosis. Ang-(1-9) ejerce efectos anti-fibróticos en el sistema cardiovascular que pueden ser mediados a través del AT2R, pero no en todos los casos. Una limitante de Ang-(1-9) es la corta vida media, el cual puede ser degradado por proteasas. Una de las estrategias para aumentar su estabilidad es usar los análogos retro-enantioméricos. El nuevo péptido así originado tendría mayor estabilidad y podría conservar su actividad biológica. Hipótesis y objetivos: Ang-(1-9) y su retro-enantiómero previenen la fibrogénesis cardiaca dependiente de TGF-β1 en cultivo primario de FC de rata neonata. Obj.1: Estandarizar las condiciones experimentales de trabajo con TGF-β1, Ang-(1-9) y el retro-enantiómero de Ang-(1-9). Obj.2: Estudiar los efectos anti-fibrogénicos de Ang-(1-9) y su retro-enantiómero. Metodología: En cultivos primarios de FC de ratas neonatas se probó la activación de TGF-β1 y su tiempo ideal de respuesta midiendo la fosforilación de Smad3 y los niveles de FN y COL-I por Western blot. Luego se estudió a distintas concentraciones de los péptidos, la citotoxicidad por ensayo del azul de tripán y ensayo con LDH. Posteriormente, se pretrató por 1h con los péptidos, para luego adicionar TGF-β1 midiendo los niveles proteicos de FN y COL-I por Western blot. Finalmente, se estudió el efecto anti-fibrogénico de estos péptidos inducido por TGF-β1, midiendo los niveles proteicos de FN y COL-I por Western blot y ensayos de contracción de geles de colágeno. Resultados: El tiempo ideal de respuesta para TGF-β1 en FC de rata neonata son 72h. Ninguna de las concentraciones de los péptidos genera efectos citotóxicos. Ang-(1-9) y R.E. no fueron efectivos en prevenir el aumento de COL-I y FN y la contracción de los geles inducidos por TGF-β1 en ninguna de las concentraciones, al contrario, generan efectos fibrogénicos similares a TGF-β1. Conclusión: Ang-(1-9) y su R.E. no previenen la fibrogénesis cardiaca y generan efectos fibrogénicos en FC de rata neonata

Introduction: Cardiovascular diseases (CVD) are the leading causes of death in Chile and the world, at the expense of pathologies such as myocardial infarction. During cardiac remodeling, the infarcted area is populated with abundant cardiac fibroblasts (CF). One of the critical factors in this process is TGF-β1, which is induced and activated in cardiac remodeling and promotes fibrosis. On the other hand, chronic activation of the renin-angiotensin system has been linked to the genesis and development of several CVD. This system plays a vital role in controlling blood pressure, and its excessive activation is associated with fibrosis. Ang-(1-9) exerts anti-fibrotic effects on the cardiovascular system mediated through AT2R. A limitation of Ang-(1-9) is the short half-life, which proteases can degrade. One of the strategies to increase its stability is to use retro-enantiomeric analogs (R.E.). The new peptide thus originated would have greater stability and could retain its biological activity. Hypothesis and objectives: Ang-(1-9) and the retro-enantiomer of Ang-(1-9) prevent TGF-β1-dependent cardiac fibrogenesis in primary culture of neonatal rat CF. Obj.1: Standardization of experimental working conditions with TGF-β1, Ang-(1-9) and the retro-enantiomer of Ang-(1-9). Obj.2: To study the anti-fibrogenic effects of Ang-(1-9) and the retro-enantiomer of Ang-(1-9). Methodology: In primary cultures of neonatal rat CF, the activation of TGF-β1 and the ideal response time were tested by measuring the phosphorylation of Smad3 and the levels of FN by Western blot. Cytotoxicity was then studied at different concentrations of the peptides by trypan blue assay and LDH assay. Subsequently, it was pre-treated for 1 h with the peptides, and then TGF-β1 was added, measuring the protein levels of FN and COL-I by Western blot. Finally, the anti-fibrogenic effect of these peptides induced by TGF-β1 was studied, measuring the protein levels of FN and COL-I by Western blot and collagen gel contraction tests. Results: The ideal response time for TGF-β1 in neonatal rat CF is 72h. None of the peptide concentrations generate cytotoxic effects. Ang-(1-9) and R.E. were ineffective in preventing the increase in COL-I and FN and the contraction of the gels induced by TGF-β1 in any of the concentrations on the contrary, they can generate fibrogenic effects similar to TGF-β1 in this model. Conclusion: Ang-(1-9) and its R.E. do not prevent cardiac fibrogenesis and they generate similar fibrogenic effects in neonatal rat CF