Efecto citoprotector de ácido ascórbico, deferoxamina y n-acetilcisteína frente al daño por isquemia/reperfusión simulada en fibroblastos cardiacos en cultivo

Abstract

El infarto agudo de miocardio es una de las principales causas de muerte global y, por lo tanto, una enfermedad que ha sido ampliamente estudiada. En el infarto, una causa que contribuye al daño celular es la reperfusión post-isquemia, mediado esencialmente por el estrés oxidativo. A este respecto, los efectos del daño por isquemia/reperfusión sobre los fibroblastos cardiacos, un tipo celular muy importante en el proceso de reparación tisular, aún se desconocen. Es bien conocido que el ácido ascórbico, la deferoxamina y la N-acetilcisteína (A/D/N) son antioxidantes con efectos cardioprotectores. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar si la asociación farmacológica entre estos antioxidantes, a concentraciones que individualmente no muestran protección, podrían conferir protección a los fibroblastos cardiacos contra el daño por isquemia/reperfusión. Para evaluar esto, los fibroblastos cardiacos de ratas neonatas fueron sometidos a isquemia/reperfusión simulada en presencia o ausencia de tratamiento con A/D/N agregado al comienzo de la reperfusión simulada. La viabilidad celular fue medida usando tinción con azul de tripán, la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) fue medida usando la sonda 2´,7´-diclorofluorescina diacetato. La muerte celular fue medida por citometría de flujo usando yoduro de propidio. Los mecanismos de señalización celular, diferenciación en miofibroblastos y síntesis de pro-colágeno tipo I fueron determinados por Western blot, mientras que la migración fue evaluada utilizando el método de la herida. Nuestros resultados muestran que la asociación A/D/N, a concentraciones donde cada uno de ellos por sí mismo no demostró actividad citoprotectora, aumentó la viabilidad de los fibroblastos cardiacos. La asociación A/D/N también disminuyó el estrés oxidativo generado en la isquemia/reperfusión simulada, indujo la fosforilación de las vías de sobrevida ERK1/2 y Akt, y disminuyó la fosforilación de las proteínas pro-apoptóticas p38 y JNK. El tratamiento con A/D/N también redujo la apoptosis inducida por la reperfusión evidenciado por una disminución en la población sub-G1, menores fragmentaciones de las pro-caspasas 9 y 3, así como también un aumento en la relación Bcl-xl/Bax. Finalmente, la isquemia/reperfusión simulada inhibió la migración inducida por suero, la diferenciación de fibroblastos cardiacos a miofibroblastos cardiacos mediados por TGF-β1, y la síntesis de pro-colágeno tipo I inducida por angiotensina II, pero estos efectos fueron prevenidos por el tratamiento con A/D/N. En conclusión, en esta Tesis se presentan los primeros antecedentes no descritos anteriormente para la asociación farmacológica A/D/N protegiendo la viabilidad y la funcionalidad de los fibroblastos cardiacos después de la isquemia/reperfusión simulada y representando, por lo tanto, una novedosa alternativa terapéutica para cardioprotección. Palabras Claves: Ácido ascórbico, deferoxamina, N-acetilcisteína, isquemia/reperfusión, fibroblastos cardiacos, especies reactivas del oxígeno

Acute myocardial infarction is one of the main causes of global death and, therefore, a disease that has been widely studied. In heart attack, one factor that contributes to cellular damage is post-ischemic reperfusion, caused essentially by oxidative stress. In this regard, the effects of ischemia/reperfusion damage on cardiac fibroblasts, a very important cell type in the tissue repair process, are still unknown. Ascorbic acid, deferoxamine, and N-acetylcysteine (A/D/N) are well known to be antioxidants with cardioprotective effects. Therefore, the objective of this study was to assess whether the pharmacological association between these antioxidants, at concentrations that individually do not show protection, could confer protection to cardiac fibroblasts against ischemia/reperfusion damage. To assess this, neonatal rat cardiac fibroblasts were subjected to simulated ischemia/reperfusion in the presence or absence of treatment with added A/D/N at the start of simulated reperfusion. Cell viability was measured using trypan blue staining, the production of reactive oxygen species (ROS) was measured using the 2´, 7´-dichlorofluorescin diacetate probe. Cell death was measured by flow cytometry using propidium iodide. The mechanisms of cellular signaling, differentiation in myofibroblasts and synthesis of pro-collagen type I were determined by Western blotting, while migration was evaluated using the wound healing assay. Our results show that the A/D/N association, at concentrations where each of them by itself did not show cytoprotective activity, increased the viability of cardiac fibroblasts. The A/D/N association also decreased oxidative stress generated in simulated ischemia/reperfusion, induced phosphorylation of the ERK1/2 and Akt survival pathways, and decreased phosphorylation of pro-apoptotic proteins p38 and JNK. Treatment with A/D/N also reduced reperfusion-induced apoptosis evidenced by a decrease in the sub-G1 population, less fragmentation of pro-caspases 9 and 3, as well as an increase in the Bcl-xl/Bax ratio. Finally, the ischemia/reperfusion inhibited serum-induced migration, differentiation of cardiac fibroblasts to cardiac myofibroblasts mediated by TGF-β1, and pro-collagen synthesis induced by angiotensin II, but these effects were prevented by treatment with A/D/N. In conclusion, this Thesis presents the first antecedents not previously described for the pharmacological association A/D/N, protecting the viability and functionality of cardiac fibroblasts after simulated ischemia/reperfusion and, therefore, representing a novel alternative therapy for cardioprotection. Keywords: Ascorbic acid, deferoxamine, N-acetylcysteine, ischemia/reperfusion, cardiac fibroblasts, reactive oxygen species