Participación del efector SseJ en la supervivencia intracelular de Salmonella typhimurium en Dictyostelium discoideum

Abstract

La patogenicidad de Salmonella se debe en gran medida a la existencia de factores de virulencia conocidos como sistemas de secreción de tipo 3 (T3SS) y sus proteínas efectoras (también llamadas “efectores”), codificados en islas de patogenicidad de Salmonella (SPIs) o en otras zonas del genoma. Los T3SS más estudiados son los que se encuentran codificados en SPI-1 y SPI-2 (T3SS-1 y T3SS-2, respectivamente). Existen diversos efectores que contribuyen a la supervivencia intracelular de la bacteria mediante distintos mecanismos. Por ejemplo, el desarrollo de la “vacuola contenedora de Salmonella” (SCV), compartimento donde reside la bacteria luego de su internalización, y la formación de estructuras conocidas como “filamentos inducidos por Salmonella” (SIFs), proyecciones membranosas que irradian desde la SCV y que se relacionan a la replicación intracelular de la bacteria. SseJ es un efector translocado al citoplasma de la célula hospedera mediante el T3SS-2. Está relacionado a la formación de los SIFs mediante la modificación de la composición lipídica de la SCV, permitiendo la proyección de estas estructuras membranosas. Asimismo, se ha reportado que una mutante ΔsseJ de S. Typhimurium presenta defectos en la supervivencia intracelular en macrófagos murinos y es atenuada en ratones. Sin embargo, no se ha estudiado el papel de este efector durante la interacción de Salmonella con hospederos alternativos. En este trabajo, se planteó dilucidar si el efector SseJ es producido y translocado al citoplasma de D. discoideum durante la infección con S. Typhimurium y si contribuye a la supervivencia intracelular de la bacteria al interior de esta ameba. Para caracterizar la secreción de SseJ, se construyó el plasmidio pMMB207::sseJ cyaA’ que codifica una fusión de este efector con el reportero CyaA’. Este plasmidio se transformó en S. Typhimurium silvestre y en mutantes que poseen inactivado el T3SS-1 o T3SS-2. Los resultados obtenidos confirmaron que SseJ es secretado in vitro a través del T3SS-2. Por otra parte, se evaluó la expresión y producción del efector SseJ bajo condiciones inductoras de los genes asociados a SPI-1 y SPI-2 mediante la construcción una fusión génica cromosomal del gen sseJ al reportero cyaA’. Nuestros resultados mostraron que la fusión se produce en respuesta a las señales ambientales que normalmente regulan la expresión del gen sseJ. Además, se evaluó mediante western blot la producción de SseJ-CyaA’ desde la fusión cromosomal durante la infección de D. discoideum. La proteína de fusión se detectó en bacterias intracelulares recuperadas desde amebas luego de 3 y 6 horas de infección, confirmando que dentro de D. discoideum existen las condiciones necesarias para la expresión y producción del efector. A pesar de esto, no fue posible confirmar experimentalmente la translocación de la proteína de fusión desde la bacteria al citoplasma de la ameba durante el proceso infectivo. Finalmente, para evaluar el rol de SseJ en la interacción de S. Typhimurium y D. discoideum se realizaron ensayos de competencia donde se comparó la supervivencia intracelular de una mutante ΔsseJ y de la cepa silvestre en esta ameba. Nuestros resultados mostraron que la mutante ΔsseJ presenta defectos de supervivencia intracelular en D. discoideum a partir de 1 hora post infección. En conjunto, esta evidencia indica que el efector SseJ de S. Typhimurium es secretado mediante el T3SS-2, se produce cuando la bacteria reside al interior de D. discoideum y contribuye en la supervivencia intracelular de S. Typhimurium en esta ameba

The pathogenicity of Salmonella is mainly due to the existence of virulence factors known as type 3 secretion systems (T3SS) and their effector proteins, also known as "effectors", encoded in Salmonella pathogenicity islands (SPIs) or in other regions of the genome. The most widely studied T3SS are those encoded in SPI-1 and SPI-2 (T3SS-1 and T3SS-2, respectively). Several effectors contribute to the intracellular survival of Salmonella by different mechanisms. For example, the development of the "Salmonella-containing vacuole" (SCV), a compartment where the bacteria reside after internalization, and the formation of structures known as “Salmonella-induced filaments” (SIFs), which are membranous projections that radiate from the SCV and are related to the intracellular replication of the bacteria. SseJ is an effector translocated to the host cell cytoplasm via T3SS-2. It is involved in the formation of SIFs by modifying the lipid composition of the SCV, allowing the projection of those membranous structures. Also, a ΔsseJ mutant of S. Typhimurium has been reported to exhibit intracellular survival defects in murine macrophages and is attenuated in mice. However, the role of this effector during the interaction of Salmonella with alternative hosts has not been studied. In this work, we aimed to elucidate if the effector SseJ is produced and translocated to the cytoplasm of D. discoideum during infection with S. Typhimurium and if it contributes to the intracellular survival of the bacteria within this amoeba. To characterize SseJ secretion, we constructed the plasmid pMMB207::sseJ_cyaA' encoding a fusion of this effector with the CyaA' reporter. This plasmid was transformed into wild-type S. Typhimurium and mutants with inactivated T3SS-1 or T3SS-2. The results obtained confirmed that SseJ is secreted in vitro through T3SS-2. Furthermore, the expression and production of the SseJ effector was evaluated under conditions that induce the expression of SPI-1- and SPI-2-associated genes by constructing a chromosomal gene fusion of the sseJ gene to the cyaA' reporter. Our results showed that the fusion is produced in response to environmental signals that regulate the expression of the sseJ gene under normal conditions. In addition, the production of SseJ-CyaA' from the chromosomal gene fusion during D. discoideum infection was assessed by western blot. The fusion protein was detected in intracellular bacteria recovered from amoebae after 3 and 6 hours of infection, confirming that the necessary conditions for expression and production of the effector exist within D. discoideum. Despite this, it was not possible to experimentally confirm the translocation of the fusion protein from the bacterium to the amoeba cytoplasm during the infection. Finally, to evaluate the role of SseJ in the interaction of S. Typhimurium and D. discoideum, competition assays were performed comparing the intracellular survival of a ΔsseJ mutant and the wild-type strain in this amoeba. Our results showed that the ΔsseJ mutant exhibits intracellular survival defects in D. discoideum from 1 h post infection. Taken together, this evidence indicates that the S. Typhimurium effector SseJ is secreted via T3SS-2, is produced when the bacterium resides inside D. discoideum, and contributes to the intracellular survival of S. Typhimurium in this amoeba