Cuantificación de ácidos grasos de cadena corta en deposiciones de niños con diarrea por enteropatógenos y su relación con la microbiota intestinal

Abstract

La diarrea es un grave problema de salud pública mundial, y una causa importante de morbilidad y mortalidad en niños menores de 5 años. La diarrea de origen bacteriano cobra gran importancia en países en desarrollo, siendo las cepas Escherichia coli diarreogénicas (ECD) la causa bacteriana más común de diarrea en dichos países. La capacidad de las cepas ECD para colonizar el epitelio intestinal depende de la expresión de factores de virulencia en el sitio de infección, el cual es un proceso altamente regulado y relacionado con la interacción del patógeno con el ambiente intestinal del hospedero. La microbiota intestinal y los metabolitos producidos en ella cumplen roles fundamentales para mantener la salud del hospedero. En este sentido, los ácidos grasos de cadena corta (SCFA) han tenido un papel clave en el desarrollo de la enfermedad diarreica, ya que distintas investigaciones le han otorgado un rol dual a los SCFA, ya sea protectores para el desarrollo de la diarrea como moléculas de señalización para el proceso infeccioso de los enteropatógenos. Los datos preliminares obtenidos en nuestro laboratorio han identificado una microbiota y un metaboloma distintivo en deposiciones de niños con diarrea positivos para ECD a comparación de niños sanos. Además, se evidenciaron niveles de acetato, propionato y butirato aumentados en los niños con diarrea. Considerando estos antecedentes, se postuló la siguiente hipótesis: “Los niveles de SCFA en deposiciones de niños con diarrea por ECD están significativamente aumentados en comparación de niños sanos, asociándose a una microbiota intestinal productora de estas moléculas”. Para responder esta hipótesis, en primera instancia, se determinó la concentración de acetato, propionato y butirato en deposiciones de niños con diarrea por ECD y niños sanos. Para esto, se cuantificaron los niveles de SCFA mediante HPLC, método que tuvo que ser estandarizado y validado previamente en nuestro laboratorio, teniendo que cumplir con los criterios de aceptación requeridos en el manual de ISP. Este análisis mostró que existen concentraciones más altas de acetato, propionato y butirato en las deposiciones de niños con diarrea por ECD en comparación con niños sanos. En segundo lugar, se correlacionaron los niveles de SCFA encontrados con una microbiota productora de estas moléculas en niños con diarrea por ECD y niños sanos. Para esto, se extrajo el ADN de las muestras de deposición de niños pertenecientes a estos dos grupos y luego amplificar y secuenciar el gen que codifica el ARN ribosomal 16S. Con estas secuencias, se realizó un estudio bioinformático que permitió caracterizar la microbiota asociada a cada grupo. En este análisis, se confirmó que en el grupo ECD existe una microbiota distintiva a comparación del grupo sano, además de mayores niveles de abundancia relativa de los géneros de bacterias productoras de SCFA Veillonella y Streptococcus en los niños con diarrea por ECD a comparación del grupo sano. Adicionalmente, un análisis de correlación mostró que la producción de acetato se correlaciona positivamente con el género Blautia, mientras que la producción de propionato y butirato se correlaciona positivamente con el género Coprococcus en los niños con diarrea por ECD. La producción de butirato se correlacionó positivamente con los géneros Faecalibacterium y Roseburia tanto en el grupo ECD como en el grupo control, y el género Bacteroides fue el único que se correlacionó negativamente en la producción de acetato y propionato en el grupo control. En conjunto nuestros resultados indican que el aumento en los niveles de SCFA encontrados se correlacionan con la presencia de géneros específicos de bacterias productoras de SCFA, pero no con el aumento o disminución en la abundancia relativa de estos géneros tanto en niños con diarrea por ECD como niños sanos

Diarrhea is a serious global public health problem, and a major cause of morbidity and mortality in children under 5 years of age. Bacterial diarrhea is of great importance in developing countries, with Diarrheogenic Escherichia coli (DEC) strains being the most common bacterial cause of diarrhea in these countries. The ability of DEC strains to colonize the intestinal epithelium depends on the expression of virulence factors at the site of infection, which is a highly regulated process related to the interaction of the pathogen with the intestinal environment of the host. The intestinal microbiota and the metabolites produced in it play fundamental roles in maintaining the health of the host. In this sense, short-chain fatty acids (SCFA) have played a key role in the development of diarrheal disease, since different investigations have given a dual role to SCFA, either protective for the development of diarrhea and signaling molecules for the infectious process of enteropathogens. Preliminary data obtained in our laboratory have identified a distinctive microbiota and metabolome in stools of children with DEC-positive diarrhea compared to healthy children. In addition, increased acetate, propionate, and butyrate levels were found in children with diarrhea. Considering this background, the following hypothesis was postulated: "SCFA levels in stools of children with DEC diarrhea are significantly increased compared to healthy children, being associated with an intestinal microbiota that produces these molecules." To answer this hypothesis, in the first instance, the concentration of acetate, propionate and butyrate in stools of children with diarrhea due to DEC and healthy children was determined. For this, SCFA levels were quantified by HPLC, a method that had to be previously standardized and validated in our laboratory, having to meet the acceptance criteria required in the ISP manual. This analysis showed that there are higher concentrations of acetate, propionate, and butyrate in the stools of children with DEC diarrhea compared to healthy children. Second, SCFA levels found were correlated with a microbiota that produced these molecules in children with DEC diarrhea and healthy children. For this, the DNA of the stool samples of children belonging to these two groups was extracted and then the gene encoding the 16S ribosomal RNA was amplified and sequenced. With these sequences, a bioinformatic study was carried out that made it possible to characterize the microbiota associated with each group. In this analysis, it was confirmed that in the DEC group there is a distinctive microbiota compared to the healthy group, in addition to higher levels of relative abundance of the genera of SCFA-producing bacteria Veillonella and Streptococcus in children with DEC diarrhea compared to the group healthy. Additionally, a correlation analysis showed that acetate production was positively correlated with the genus Blautia, while propionate and butyrate production was positively correlated with the genus Coprococcus in children with DEC diarrhea. The production of butyrate was positively correlated with the genera Faecalibacterium and Roseburia in both the DEC group and the control group, and the genus Bacteroides was the only one that was negatively correlated in the production of acetate and propionate in the control group. Taken together, our results indicate that the increase in the levels of SCFA found correlate with the presence of specific genera of SCFA-producing bacteria, but not with the increase or decrease in the relative abundance of these genera, both in children with diarrhea due to DEC and healthy children