Desarrollo de una metodología analítica para determinar Cotinina y trans-3’-Hidroxicotinina en orina mediante la microextracción por sorción con disco rotatorio (RDSE) y cuantificación en GC-MS

Abstract

Un contaminante emergente de gran renombre estos últimos años ha sido la Nicotina. La Nicotina es el componente principal del humo del tabaco, pero este a la vez se metaboliza en diversos otros compuestos químicos dañinos para la salud. La Cotinina es el metabolito que se genera en mayor concentración, y este a su vez, se convierte en trans-3´-Hidroxicotinina. Se han reportado diversos estudios de efectos adversos para la salud el estar expuesto a estos metabolitos de forma prolongada, no solamente en fumadores activos, sino que también en fumadores pasivos, ya que estos últimos se encuentran expuestos silenciosamente sin tener un control del tiempo o concentraciones que se van acumulando. La cuantificación de este tipo de analitos está dada principalmente en muestras biológicas como el plasma, el pelo, las uñas y la orina, siendo esta última la de interés en el presente estudio por su fácil recolección y de mayor acceso respecto a otras, pero a la vez puede ser un gran desafío debido a las bajas concentraciones que se pueden encontrar, necesitándose rigurosos pasos de preparación de muestra antes de su determinación analítica. En este trabajo se desarrolló una metodología analítica para la determinación de la Cotinina y la trans-3´-Hidroxicotinina desde muestras de orina, mediante la técnica de microextracción por sorción en disco rotatorio (RDSE), y su posterior detección y cuantificación mediante cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas (GC-MS). RDSE se seleccionó por ser una técnica económica, versátil y ecoeficiente (química verde), mientras que GC-MS ofrece una buena sensibilidad y límites de detección bajos para la investigación en muestras complejas. Los analitos son retenidos y pre concentrados en la fase sorbente Oasis MCX, la cual se encuentra inmovilizada sobre un disco rotatorio con cavidad central. Las condiciones óptimas de extracción fueron: Una agitación de 2000 rpm por un tiempo de 60 minutos, volumen de muestra de 20 mL (2 mL de orina y 18 mL de solución acida de HCl 0.5), “clean up” post extracción con 10 mL de una solución metanol – agua (30:70) por 20 minutos, desorción de una etapa de 20 minutos con 10 mL de una solución amoniaco-metanol (20:80). Posteriormente el extracto se evaporó con nitrógeno hasta sequedad para seguir con la derivatización donde al eluato seco se le agregó 50 μL del derivatizante N-metil-N-(trimetilsilil)-trifluoroacetamida (MSTFA) y 50 μL de piridina llevando esto a un ambiente de 70°C por 30 minutos. Una vez realizada la derivatización, se inyectó 2 μL de muestra en el GC-MS. Además, en el proceso se incorporó un estándar “surrogate” rac-Cotinine-D3. Los límites de detección y cuantificación del método fueron de 0.7μg·L-1 y 0,9μg·L-1 para tran-3’-Hidroxicotinina respectivamente y de 21 μg·L-1 y 29 μg·L-1 para Cotinina respectivamente. Las recuperaciones en muestras blanco de orina que fueron enriquecidas con 250 μg·L-1 de los analitos y fueron de un 56% para trans-3’- Hidroxicotinina y de un 86% para Cotinina. El método descrito fue aplicado en 8 muestras reales provenientes tanto de mujeres como de hombres en un amplio rango de edad (4 a 84 años) correspondientes tanto a fumadores activos como a fumadores pasivos. La concentración de los analitos detectados se obtuvo en un intervalo de 475-1119 μg·L-1 para trans-3´- Hidroxicotinina y de 113-1108 μg·L-1 para Cotinina