Silenciamiento del gen ninA de Penicillium roqueforti y su efecto en la producción de metabolitos secundarios

Abstract

Penicillium roqueforti es un hongo filamentoso de interés biotecnológico que produce andrastina y ácido micofenólico, dos metabolitos secundarios (MS) con actividades biológicas de uso farmacológico. Adicionalmente, esta especie presenta numerosos clusters génicos de biosíntesis de MS (BGCs, por su sigla en inglés) que aún no han sido caracterizados y vinculados a un compuesto, uno de estos es el BGC ninA. Durante un estudio preliminar, se encontró que, al silenciar la expresión del gen principal del BGC ninA, que codifica para la enzima principal NinA, no había producción de andrastina y ácido micofenólico, lo que sugirió un posible efecto crosstalk entre esos dos BGCs y el BGC ninA. El crosstalk es un fenómeno poco estudiado en hongos filamentosos, en dónde un BGC altera la producción de metabolitos de otro. Sin embargo, dicho fenómeno no pudo ser confirmado debido a la ausencia de un análisis de transcrito. El objetivo de este estudio fue analizar bioinformáticamente el BGC ninA para identificar nuevos componentes y comprobar el efecto de crosstalk entre el gen ninA y los BGCs de andrastina y ácido micofenólico. Para ello, se utilizó las plataformas fungiSMASH y BLASTP para describir los genes presentes y encontrar proteínas similares. Además, empleando ARN de interferencia se silenció el gen ninA y se evaluó su efecto en la producción de transcrito de los genes principales de los BGCs de andrastina y ácido micofenólico, y en la producción de dichos metabolitos. En resumen, el estudio arrojó que el BGC ninA presenta 14 genes putativos, de los cuales tres corresponden a factores de transcripción de tipo dedos de Zinc (ft-60, ft-62 y ft-64). El BGC ninA es similar a los BGCs de síntesis de cinco compuestos producidos por especies del género Fusarium, y esta similitud indica que probablemente sean los factores Ft-60 y Ft-62 quienes comanden la producción del metabolito de ninA. Finalmente, el silenciamiento del gen ninA refutó la hipótesis de crosstalk debido a que no se obtuvo una reducción en la producción de andrastina y ácido micofenólico, ni una reducción considerable en la producción de transcrito en las transformantes atenuadas. Se espera estudiar en un futuro el rol de los factores Ft-60 y Ft-62 en el metabolismo secundario del hongo, e intentar descifrar la ruta biosintética generada por el BGC ninA.

Penicillium roqueforti is a filamentous fungus of biotechnological importance that produces andrastin A and mycophenolic acid, two secondary metabolites (MS) with biological activities and pharmacological uses. Additionally, this fungal species has multiple biosynthetic gene clusters (BGCs) without a link with a known compound, being one of them the cluster ninA. In the past, a study found that when the expression of gene ninA, which codes for the core enzyme NinA, was silenced the production of andrastin and mycophenolic acid were blocked totally. This experimental fact strongly suggested a possible crosstalk between these BGCs. The crosstalk is a poorly studied phenomenon in filamentous fungi which a BGC influences the metabolites production from another clusters. However, the crosstalk between BGC ninA and the BGCs of andrastin and mycophenolic acid could not be proved due the absence of a transcriptional analysis. The objective of this study was to perform a bioinformatic analysis to the BGC ninA and to analyze the crosstalk effect between the NinA enzyme and the BGCs of andrastin A and mycophenolic acid. For that, a bioinformatic analysis of the BGC ninA was performed using fungiSMASH and BLASTP. The gene ninA was silenced using the RNAi technique. Finally, the production of andrastin A and mycophenolic acid, and the transcript-level of the core enzymes for their production were evaluated in the transformant strains. In summary, it was found that BGC ninA has fourteen putative genes, being three of them Zn2Cys6 transcription factors (ft-60, ft-62, ft-64). In addition, the BGC ninA is similar to five BGCs from the genus Fusarium. This similarity suggests that transcription factors Ft-60 and Ft-62 are involved in the regulation of the metabolite ninA production. Finally, the analysis of strains with down expression of gene ninA refutes the initial hypothesis because the andrastin A and the mycophenolic acid production are not altered. In future works, the Ft-60 and Ft-62 function will be studied to elucidate the regulation of BGC ninA.