Estudio del tráfico local de la proteína L1CAM en axones de neuronas del sistema nervioso central

Abstract

Las neuronas son células altamente compartimentalizadas y polarizadas en 2 dominios funcional y estructuralmente distintos: el somato-dendrítico y el axonal. La mantención y diferenciación de ambos dominios es fundamental para la función neuronal y dependen principalmente de su pool proteico. Si bien el proteoma axonal está principalmente determinado por el transporte axonal rápido de proteínas desde el soma, este mecanismo podría ser insuficiente al responder a los requerimientos del proteoma distal en procesos como el desarrollo y guía axonal. En los últimos años, diversos estudios han reportado que axones y dendritas son capaces de sintetizar y exportar proteínas a través de rutas secretoras locales independientes del soma. En axones se ha descrito ampliamente la presencia de ARN mensajeros (ARNm) de proteínas solubles y de membrana; ribosomas; componentes traduccionales, por ejemplo, EIF2α y ARN de transferencia; retículo endoplásmico y algunos marcadores estructurales del aparato de Golgi como Giantin. Sin embargo, la existencia y funcionalidad de un aparato de Golgi ha sido escasamente estudiada. Evidencia reciente de nuestro laboratorio indica que las estructuras tipo-Golgi, denominadas Golgi satélites, están presentes a lo largo de axones de nervio ciático y que participan en el tráfico local del canal iónico TRPM8, lo que sugiere la existencia de una ruta de tráfico dependiente de Golgi satélites en axones. Una proteína axonal fundamental en el desarrollo del sistema nervioso, crecimiento y guía axonal es la molécula de adhesión celular L1 (L1CAM). La ruta de destinación axonal clásica de esta proteína se denomina transcitosis que está gobernada exclusivamente por mecanismos de tráfico somático. Sin embargo, publicaciones recientes han evidenciado que el ARNm de L1CAM está presente en axones del sistema nervioso central (SNC) y que podría sintetizarse y exportarse localmente como una manera complementaria a la transcitosis. Sin embargo, se desconocen los mecanismos que subyacen el tráfico local de esta proteína en el axón. En este trabajo, hipotetizamos que la proteína L1CAM es capaz de secretarse localmente a desde el retículo endoplásmico axonal hacia la superficie de axones aislados del SNC y que en este proceso participan estructuras Golgi satélite. Para validar nuestra hipótesis, utilizamos muestras de axones aislados de neuronas corticales utilizando cámaras de microfluido. Mediante un sistema de retención y liberación basado en los dominios FM, encontramos que L1CAM es secretada desde el retículo endoplásmico axonal hacia la superficie independiente del soma. Evaluamos la expresión de Golgi satélites axonales y su sensibilidad a bloqueadores del aparato de Golgi, descubriendo que los GS axonales son sensibles a estas drogas. Finalmente, encontramos que la exportación local de L1CAM depende de estructuras tipo-Golgi en axones aislados. En conclusión, nuestros resultados muestran por primera vez que en axones del SNC existe una ruta de tráfico autónoma en la que participan estructuras tipo-Golgi. Este hallazgo abre nuevas interrogantes sobre la naturaleza y función de las estructuras tipo-Golgi axonales y su participación en el tráfico local de proteínas.

Neurons are highly compartmentalized and polarized cells with two functionally and structurally distinct domains: somato-dendritic and axonal domain. The maintenance and differentiation of both domains is essential for neuronal function and depends mainly on the axonal proteome. Although the axonal proteome is primarily determined by the fast-axonal transport of proteins from the soma, this mechanism may be insufficient in responding to the requirements of the distal proteome in processes such as axonal development and guidance. In recent years, various studies have reported that axons and dendrites are capable of synthesizing and exporting proteins through the local secretory pathway independent of the soma. The presence of mRNAs (for soluble and membrane proteins); ribosomes; translational components, Eif2α and tRNAs, for example; endoplasmic reticulum and structural markers of the Golgi apparatus such as Giantin, has been widely described in axons. However, the existence and functionality of an axonal Golgi apparatus has been poorly studied. Recent evidence from our laboratory indicates that the Golgi-like structures, called Golgi satellites, are present along the axons of sciatic nerve participating in the local traffic of the TRPM8 ion channel, suggesting the existence of a local axonal that depends on the Golgi satellites. A fundamental axonal protein in the nervous system development, growth and axonal guidance is the L1 cell adhesion molecule (L1CAM). The classic axonal destination pathway for this protein is called transcytosis, which is governed exclusively by a somatic trafficking mechanism. However, recent publications have shown that L1CAM mRNA is present in CNS axons suggesting that it is synthesized and exported locally as a complement to the transcytosis pathway. Nevertheless, the mechanism underlying the local trafficking of this protein in axons is unknown. In this work, we hypothesize that L1CAM protein is capable of been locally secreted from axonal endoplasmic reticulum to the axonal surface in isolated CNS axons and that Golgi satellite structures participate in this process. To validate our hypothesis, we isolated axons from cortical neurons using microfluidic chambers. Taking advantage of a retention/release system based on FM domains, we found that L1CAM traffics from axonal endoplasmic reticulum to the axonal surface independent of the soma. We evaluated the expression of axonal Golgi satellites and their sensitivity to Golgi apparatus blockers, discovering that axonal Golgi satellites are sensitive to both drugs. Finally, we found that local trafficking of L1CAM depends on Golgi-like structures in isolated axons. In conclusion, our results show for the first time the existence of an autonomous secretory route in CNS axons in which Golgi-like structures are involved. This finding opens new questions about the nature and function of axonal Golgi-like structures and their participation in local protein trafficking in axons.