Estudio genético y celular de variantes germinales presentes en genes de microRNAs asociados a cáncer de mama familiar en pacientes chilenas

Abstract

Cerca del 10% de los casos de cáncer de mama (CM) presentan alteraciones genéticas heredables. Pese a los esfuerzos por encontrar genes de susceptibilidad que expliquen estos casos todavía existe un 50% cuya etiología genética aún se desconoce. Se postula que una combinación desfavorable de genes de moderada a baja penetrancia estaría dando cuenta del aumentado riesgo del CM familiar. En CM existe un grupo de miRNAs que se encuentran comúnmente desregulados, esto podría deberse a variantes en la secuencia de estos genes que estarían alterando su transcripción, procesamiento y/o la interacción con sus mRNAs blancos. Por lo tanto, es importante estudiar los SNPs que están presentes en estos genes que se asocien a CM y validar su efecto funcional in vitro, por lo cual se plantea la siguiente hipótesis: “Variantes germinales en la secuencia de algunos miRNAs se asocian con CM familiar en pacientes chilenos sin mutación en los genes BRCAs, los cuales alteran los niveles de expresión del miRNA maduro, la actividad sobre sus blancos celulares conocidos y modifican el fenotipo de células de cáncer de mama”. Para abordar esta hipótesis, se plantearon los siguientes objetivos: (1) Identificar variaciones en la secuencia de 11 genes de miRNAs en pacientes sin mutaciones en los genes BRCAs. (2) Determinar las frecuencias alélicas y genotípicas de las variantes presentes en los 11 miRNAs y establecer su asociación con el riesgo a desarrollar CM familiar. (3) Evaluar características moleculares y celulares relacionadas con progresión tumoral y malignidad en líneas de CM que expresan ectópicamente los miRNAs polimórficos. Se seleccionaron 11 miRNAs desregulados en CM, con el objetivo de identificar variantes presentes en estos genes que estén alterando su expresión y que podrían conferir susceptibilidad a CM familiar en población chilena. Los miRNAs seleccionados corresponden a: miR-10b, miR-21 miR-125a, miR-145, miR-155, miR-497/miR-195, miR-221, miR-222, miR-335 y miR-520c. Estos miRNAs se secuenciaron en 100 casos con CM con fuerte historia familiar y negativos para mutaciones en los genes BRCAs. Se identificaron 17 variantes, de estas se seleccionaron 3 para el estudio de asociación (rs190708267, rs376491654 y rs755634302) considerando que: a) se encuentran en el pre-miRNA o próximas a este y b) que el análisis in silico sugirió que alteran la estructura secundaria de los pri-miRNAs. Usando un diseño caso-control las variantes se genotiparon en 440 casos con CM familiar sin mutaciones en los genes BRCAs y en 1031 controles sanos. No se observaron diferencias significativas entre casos y controles para las variantes rs376491654 y rs755634302. Con respecto al rs190708267 C>T, el alelo T se detectó sólo en 4 casos con CM y en ningún control (OR= 21,17 [95% 1,14 - 394] p= 0,0079), no se detectaron homocigotos TT ni en los casos ni en los controles, asociando al alelo T con riesgo a CM. Dado que el miR-155 tiene un importante rol en la carcinogénesis encontrándose sobreexpresado en varios tipos de cáncer incluido CM, se estudió el efecto funcional in vitro del rs190708267 presente en este miRNA para confirmar su contribución a la etiología del CM. Se encontró que la presencia del alelo T eleva significativamente los niveles de expresión del miR-155 maduro, sugiriendo que la presencia del alelo de riesgo en la región flanqueante del pre-miRNA alteraría su procesamiento. Al evaluar el efecto funcional de esta variante en las propiedades celulares relacionadas con malignidad se encontró que no tiene efecto sobre la evasión de la apoptosis, pero sí aumenta la capacidad migratoria de células de CM, alterando también los niveles de algunos marcadores de transición epitelio mesenquimal (EMT) como E-cadherina y Ncadherina. También se observó que las células que sobreexpresan el alelo T son más resistentes a cisplatino en comparación con aquellas que sobreexpresan el alelo C. Se realizó un análisis in silico de los posibles mRNAs blanco de este miRNA para seleccionar aquellos que estuvieran involucrados en carcinogénesis, encontrando varios miembros de la vía Wnt/β-catenina como: APC, GSK3-β y PP1. Así se evaluó el efecto de la variante sobre la alteración en los niveles de expresión de estos mRNAs blanco y se encontró que el alelo de riesgo disminuye la expresión de los reguladores negativos de la vía Wnt/β-catenina, APC y GSK3-β, mientras que aumenta los niveles de PP1. Estos resultados sugieren que la variante rs190708267 presente en el primiR-155 confiere susceptibilidad a CM y promueve características de malignidad tumoral en CM.

Genetically inherited alterations occur in almost 10% of cases of breast cancer (BC). Despite efforts to find gene susceptibility to explain these cases, there is a 50% whose genetic etiology is unknown. It is postulated that an unfavorable combination of moderate to low penetrance would be the answer for the increased risk of familial BC. There is a group of miRNAs commonly unregulated in BC. This could be due to sequence variations in these genes that would be altering their transcription, processing and/or interaction with their mRNAs target. Therefore, it is important to study the SNPs present in these genes that are associated with BC as well as to validate their functional effect in vitro. Thus, the following hypothesis is proposed: "Germinal variants in the sequence of some miRNAs are associated with familial BC in Chilean patients with no mutation in BRCAs genes, which alter the expression levels of the mature miRNA, the activity on their known cellular targets and modify the phenotype of breast cancer cells". To address this hypothesis, the following objectives were proposed: (1) Identify variations in the sequence of 11 genes of miRNAs in patients with no mutations in BRCAs genes. (2) Determinate the allelic and genotypic frequencies of the variants present in 11 miRNAs and establish their association with the risk of developing familial BC. (3) Evaluate molecular and cellular characteristics related to tumor progression and malignancy in BC lines that ectopically express the polymorphic miRNAs. Eleven unregulated miRNAs in BC were selected with the aim of identifying variants present in these genes which alter their expression and could confer susceptibility to familial BC in Chilean population. The miRNAs were: miR-10b, miR-21 miR-125a, miR-145, miR-155, miR-497 / miR-195, miR-221, miR-222, miR-335 and miR-520c. They were sequenced in 100 cases with BC with strong family history, and negative for mutations in BRCAs genes. Seventeen variants were identified. Of which, 3 were selected for an association study (rs190708267, rs376491654 and rs755634302) by considering that: a) are found in the pre-miRNA or next to this and b) in silico analysis suggested that they alter secondary structure of the pri-miRNAs. Using a case-control design, the variants were genotyped in 440 cases with familial BC without mutations in BRCAs genes and 1031 healthy controls. There were no significant differences between cases and controls for variants rs376491654 and rs755634302. Respect to rs190708267, the T allele was detected only in 4 cases with BC and in any control (OR = 21.17 [95% 1.14-394] p = 0.0079), no TT homozygotes were detected in the cases nor in controls associating the T allele with BC risk. Given that the miR-155 plays an important role in carcinogenesis, being overexpressed in several types of cancer including BC, the in vitro functional effect of rs190708267 in this miRNA was studied to confirm its contribution to the etiology of BC. The T allele significantly raised the levels of mature miR-155, suggesting that the presence of the risk allele in the flanking region of pre-miRNA would alter its processing. The functional effect of this variant on malignant properties was evaluated, being found no effect on the evasion of apoptosis, but it does increase the migratory capacity of BC cells, altering the levels of some EMT markers such as E- cadherin and N-cadherin. Cells overexpressing the T allele were more resistant to cisplatin compared to those overexpressing the C allele. An in silico analysis of putative mRNAs involved in carcinogenesis, finding several members of the Wnt/β-catenin pathway, including as: APC, GSK3-β and PP1, were interesting targets. Thus, we evaluated the effect of the variants on expression levels of these mRNAs, being found that the risk T allele promoted a decreased expression of the negative regulators of the Wnt/β-catenin pathway, APC and GSK3-β, while increased the levels of PP1. These results suggest that the variant rs190708267 a the pri-miR-155 confers susceptibility to BC and promotes malignant characteristics in BC.