Contractility through the mechanosensors αVβ3 Integrin/Syndecan-4 in astrocytes

Abstract

Las lesiones del sistema nervioso central cambian química y físicamente el entorno de las neuronas y las células gliales mediante la liberación de moléculas proinflamatorias y proteínas de la matriz extracelular, generando una matriz más rígida. Estos cambios desencadenan estímulos mecánicos que pueden afectar muchas respuestas celulares, incluida la motilidad, la proliferación y la diferenciación celular. El entorno proinflamatorio induce la reactividad de los astrocitos, un mecanismo por el cual los astrocitos extienden sus procesos y migran al tejido dañado. Los astrocitos reactivos tienen un fenotipo que se caracteriza por la presencia de fibras de estrés y adhesiones focales, estructuras que conducen a la contractilidad celular. La integrina αVβ3 y el Syndecan-4 son proteínas clave expresadas por estos astrocitos reactivos y son receptores de la glicoproteína de superficie neuronal Thy-1, que promueve una mayor contractilidad celular tras la unión del ligando, y un aumento de la motilidad de los astrocitos. Por otro lado, αVβ3 Integrina y Syndecan-4 se han descrito como mecanosensores en fibroblastos cuando éstos son estimulados por fuerzas mecánicas generadas por una mayor rigidez de la matriz extracelular secretada por los mismos fibroblastos. Sin embargo, este fenómeno no ha sido estudiado en astrocitos y el papel de la αVβ3 Integrina y Syndecan-4 en astrocitos estimulados por estresores físicos, junto con los cambios en su fenotipo reactivo no se conocen. Además, en los fibroblastos, Syndecan-4 es una proteína importante que regula el reciclaje de la integrina αVβ3 a la superficie celular a través de la fosforilación de tirosina 180 mediada por Src en Syndecan-4. Las vías canónicas río debajo de los receptores de integrina incluyen la activación de la quinasa Src por la quinasa de adhesión focal y esta Src activada podría fosforilar la tirosina 180 de Syndecan-4. Por lo tanto, proponemos que el estrés mecánico es detectado por el mecanorreceptor de astrocitos Syndecan-4, aumentando los niveles de superficie de integrina αVβ3, la contractilidad celular y las fuerzas de tracción ejercidas por las integrinas inducidas por Thy-1 a través de la fosforilación de la Y180 de Syndecan-4. En esta tesis, estudiamos la contractilidad celular después de la estimulación mecánica midiendo la fosforilación de la cadena liviana de la miosina por inmuno-transferencia y monitoreando las fibras de estrés y la formación de adhesiones focales con ensayos de inmuno-fluorescencia indirecta. Para estudiar los niveles de integrina después de la estimulación mecánica, medimos los niveles de superficie de la integrina αVβ3 mediante análisis de células activadas por fluorescencia [FACS], utilizando la sobreexpresión y el silenciamiento de Syndecan-4, y los dos mutantes disponibles: formas no-fosforilable y fosfomimética, donde el residuo de tirosina 180 de Syndecan-4 se muta a L o E, respectivamente. Para estudiar la fuerza de tracción, utilizamos microscopía de fuerza de tracción con Thy-1 y estímulos de estrés mecánico. Encontramos un aumento más rápido de los niveles de superficie de integrina αVβ3 en astrocitos estimulados con fuerzas mecánicas en comparación con células no estimuladas o estimuladas con Thy-1 solamente, y que esta respuesta dependía de la fosforilación de Syndecan-4 en tirosina 180. Por otro lado, también encontramos un aumento de las fibras de estrés y formación de adhesiones focales a través de la activación de la vía β3 Integrina / pY180 Syndecan-4. Finalmente, encontramos que las fuerzas de tracción aumentaron en las células estimuladas con Thy-1 y que los valores fueron aún más altos cuando se agregó estrés mecánico. En conjunto, nuestros resultados nos ayudan a comprender los eventos fisiopatológicos que tienen lugar durante un daño al sistema nervioso central, el papel de los cambios en la rigidez de la matriz extracelular y las fuerzas ejercidas por la comunicación célula-célula sobre los mecanosensores integrina αVβ3 y Syndecan-4 en astrocitos. Más importante aún, nuestros hallazgos nos ilustran sobre los mecanismos por los cuales los niveles de integrina αVβ3 aumentan en los astrocitos, un evento que modula la reactividad de estas células.

Injuries to the central nervous system chemically and physically change the environment of neurons and glial cells through the release of pro-inflammatory molecules and extracellular matrix proteins, generating a more rigid matrix. These changes create mechanical stimuli that can affect many cellular responses, including motility, proliferation, and differentiation. The pro-inflammatory environment induces astrocyte reactivity, a mechanism by which astrocytes extend their processes and migrate to the wounded tissue. Reactive astrocytes have a phenotype characterized by the presence of actin stress fibers and focal adhesions, structures that lead to cellular contractility. αVβ3 Integrin and Syndecan-4 are key proteins expressed by these reactive astrocytes and are reported receptors of the neuronal surface glycoprotein Thy-1, which promotes higher cell contractility upon ligand binding, and astrocyte increased motility. On the other hand, αVβ3 Integrin and Syndecan-4 have been described as fibroblast mechanosensors when stimulated with mechanical forces generated by increased stiffness of the extracellular matrix secreted by the same fibroblasts. However, the role of αVβ3 Integrin and Syndecan-4 in astrocytes stimulated by physical stressors, together with the changes in their reactive phenotype have not been studied. Additionally in fibroblasts, Syndecan-4 is an important protein that regulates recycling of αVβ3 Integrin to the cell surface through Src-mediated phosphorylation of tyrosine 180 in Syndecan-4. Canonical pathways downstream of integrin receptors include activation of Src kinase by Focal Adhesion Kinase and this activated Src could then phosphorylate the tyrosine 180 of Syndecan-4. Therefore, we propose that mechanical stress is sensed by the astrocyte mechanoreceptor Syndecan-4, increasing αVβ3 Integrin surface levels, cell contractility, and traction forces exerted by integrins induced by Thy-1 through the Y180 phosphorylation of Syndecan-4. We studied cell contractility after mechanical stimulation by measuring phosphorylation of myosin light chain by western blot, and by monitoring stress fiber and focal adhesion formation with indirect immunofluorescence assays. To study integrin levels after mechanical stimulation, we measured surface levels of αVβ3 Integrin by fluorescent activated cell sorting [FACS], using overexpression and silencing of Syndecan-4, and the two available mutants: non-phosphorylatable and phosphomimetic forms, where the Syndecan-4 tyrosine 180 residue is mutated to L or E, respectively. To study traction force, we used traction force microscopy with Thy-1 and mechanical stress stimuli. We found faster increase of surface levels of αVβ3 Integrin in astrocytes stimulated with mechanical forces compared with non-stimulated cells and Thy-1, and that this response depended on Syndecan-4 phosphorylation on tyrosine 180. On the other hand, we also found an increase in the stress fibers and focal adhesion formation through the activation of β3 Integrin/pY180SDC4 pathway. Finally, we found that traction forces were increased in cells stimulated with Thy-1 and that values were even higher when mechanical stress was added. Taken together, our results help us to understand the pathophysiological events taking place during insults of the central nervous system, the role of the changes in rigidity of the extracellular matrix, and the forces exerted by cell-cell communication on the αVβ3 Integrin and Syndecan-4 mechanosensors in astrocytes. Most importantly, we shed light on the mechanisms by which αVβ3 Integrin levels increase in astrocytes, an event that modulates astrocyte reactivity.