La estabilización de HIF-1α induce la expresión de GEFS claves para la activación de RAB5

Abstract

INTRODUCCIÓN: Estudios previos de nuestro laboratorio evidenciaron que la GTPasa pequeña Rab5 promueve la adquisición y mantención de características de malignidad tumoral en condiciones de hipoxia, lo cual pareciera ser dependientes del factor de transcripción HIF-1α, pero sin cambios evidentes en los niveles de Rab5 total, sino que solo se observó un incremento de su activación. Este aumento de Rab5-GTP dependiente de la hipoxia potenció posteriormente la migración, invasión y metástasis en modelos tanto in vitro como in vivo. Dado que la activación de Rab5 es promovida por factores de intercambio de nucleótido de guanina (GEFs) específicos, y que algunos de ellos participan en la migración celular, se plantea la siguiente hipótesis: “La estabilización de HIF-1α aumenta los niveles de Rab5-GTP mediante la inducción transcripcional de GEFs, promoviendo la migración e invasión tumoral en las líneas celulares A549 y RCC”. Para abordar esta hipótesis, se plantearon los siguientes objetivos: (1) Determinar si HIF-1α induce la activación de Rab5 por estímulos dependientes e independientes de hipoxia celular. (2) Identificar GEFs de Rab5 inducidas por hipoxia y determinar si esta inducción depende de HIF-1α. (3) Determinar si la GEF ALS2 inducida por HIF-1α participa en la activación de Rab5, la migración y la invasión de células tumorales en hipoxia. METODOLOGÍA: Los niveles de Rab5-GTP fueron medidos utilizando la técnica de pull-down en la línea celular de carcinoma renal RCC, RCC+vhl y en la línea celular de adenocarcinoma pulmonar A549. La expresión y actividad de HIF-1α fueron disminuidas mediante la transfección de RNAs interferentes (siRNAs) y con el uso de un inhibidor farmacológico selectivo contra HIF-1α (inhibidor C26H29NO5 ), respectivamente. Ambos tratamientos fueron realizados en condiciones de hipoxia y normoxia por 24 h. Además, se midieron los niveles de Rab5-GTP de forma independiente a la hipoxia, determinándose la dependencia de HIF-1α mediante la transfección ectópica con los plasmidios codificantes para HIF-1α/WT o HIF-1α/P402A/P564A (mutante no degradable) en normoxia, y el uso de células RCC que estabilizan a HIF-1α de forma endógena. Los niveles de mRNA de las GEFs de Rab5 (Rabex-5, RIN1, RIN2, RIN3 y ALS2) se midieron por RTqPCR y posteriormente, se evaluaron los niveles proteicos de la(s) GEF(s) seleccionada(s). Además se evaluó la expresión de esta(s) GEF(s) en células de carcinoma renal RCC y RCC+vhl. Posteriormente identificamos elementos de respuesta a hipoxia (HREs)

putativos en la secuencia genética de ALS2 (una de las GEFs identificadas) mediante análisis in- sílico. Para determinar una posible interacción física entre el promotor de ALS2 y HIF-1α, se realizó

la técnica de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Finalmente, las células A549 fueron transfectadas con siRNAs contra ALS2, para luego evaluar los niveles de Rab5-GTP utilizando la técnica de pull-down, migración mediante transwell y la invasión tumoral mediante el uso de matrigeles, todo lo anterior se realizó bajo el estímulo normoxia e hipoxia. RESULTADOS: La estabilización de HIF-1α fue necesaria para la activación de Rab5 por hipoxia, como se demostró mediante los tratamientos con siRNA y el inhibidor C26H29NO5. También observamos que la estabilización de HIF-1α independientemente de la hipoxia tumoral, indujo la activación de Rab5, lo cual se demostró mediante la transfección con HIF-1α (P402A/P564A) y el uso de células RCC. También, la hipoxia aumentó los transcritos de las GEFs RIN2, ALS2 y RIN3, mientras que en el modelo celular RCC, la estabilización endógena de HIF-1α en normoxia, aumentó solo la expresión de ALS2. Posteriormente, cuando se cuantificaron los niveles proteicos, observamos que tanto las células A549 sometidas a hipoxia como las células RCC en normoxia, poseen mayores niveles proteicos de ALS2, los cuales fueron dependientes de la expresión de HIF-1α, como se observó además al utilizar el inhibidor C26H29NO5 y siRNA contra HIF-1α. Luego, mediante la técnica de ChIP en condiciones de hipoxia, se demostró que HIF-1α se une físicamente al promotor del gen de ALS2, específicamente en el HRE(-782/-788). Finalmente, se observó que ALS2 fue necesaria para la activación de Rab5, para la migración celular y la invasión de células tumorales en condiciones de hipoxia. DISCUSIÓN: En este trabajo, demostramos que la hipoxia y HIF-1α promueven la expresión de la GEF de Rab5 ALS2, la cual es necesaria para la activación de Rab5, migración e invasion celular sean inducidas en condiciones de hipoxia. También reportamos por primera vez que HIF-1α se une directamente al promotor proximal de ALS2 en células tumorales A549, presentando el primer enlace entre ALS2 y la mantención de características asociadas con la malignidad tumoral inducida por hypoxia, lo cual ocurre vía HIF-1α.

INTRODUCTION: Previous studies from our lab have shown that the small GTPase Rab5 promotes the acquisition and maintenance of characteristics associated with malignancy in hypoxia and dependent on the transcription factor HIF-1α, which stimulates Rab5 activity, leading to increased tumor cell migration, invasion and metastasis, as shown in in-vitro and in vivo models. Given that the activation of Rab5 is promoted by specific guanine nucleotide exchange factors (GEFs), and that some of them participate in cell migration, the following hypothesis is proposed: “HIF-1α increases the level of Rab5-GTP in hypoxia through the transcriptional induction of GEFs who promotes the migration and invasion of tumor cells A549 and RCC”. To address this hypothesis, the following objectives were proposed: (1) To determine if HIF-1α induces the activation of Rab5 by dependent and independent stimuli of cellular hypoxia. (2) Identify Rab5 GEFs induced by hypoxia and determine if this induction depends on HIF-1α. (3) To determine if GEF ALS2 induced by HIF-1α participates in the activation of Rab5, migration and invasion of tumor cells in hypoxia. METHODOLOGY: Rab5-GTP levels were measured in pull-down assays, using two complementary models, A549 lung adenocarcinoma cells exposed to hypoxia, and the renal cell carcinoma (RCC and RCC+vhl) model, which allows endogenous stabilization of HIF-1α (independently of hypoxia). HIF-1α expression and activity were reduced by small interference RNA (siRNA) and pharmacological inhibition (C26H29NO5 inhibitor of HIF-1α), respectively. These treatments were performed under normoxia or hypoxia for 24 h. Moreover, Rab5-GTP levels were measured independently of hypoxia upon ectopic transfection with plasmids encoding for HIF-1α/WT and HIF-1α/P402A/P564A (non-degradable mutant) and in RCC cells exposed to the C26H29NO5 inhibitor. The mRNA levels for Rab5-GEFs Rabex-5, RIN1, RIN2, RIN3 and ALS2 were

measured by RT-qPCR, and then, selected GEFs were validated by Western blotting in RCC (non- hypoxia) and A549 (hypoxia) models, and the requirement of HIF-1α was evaluated by siRNA and

pharmacological inhibition. Thereafter, by an in-silico analysis, we identified putative Hypoxia Response Elements (HREs) in the promoter region of the gene encoding for ALS2. To evaluate a possible interaction between the ALS2 promoter and HIF-1α, we performed Chromatin ImmunoPrecipitation assays (ChIP). Finally, A549 cells were transfected with siRNA sequences targeting ALS2, to evaluate its requirement for Rab5-GTP loading, cell migration and invasion induced by hypoxia. RESULTS: HIF-1α was required for Rab5 activation by hypoxia, as shown by several approaches, including siRNA targeting and pharmacological inhibition of HIF-1α under hypoxic conditions. Also, we observed that HIF-1α stabilization (independently of hypoxia) is enough to promote Rab5 activation, as shown in transfection experiments with a stabilized mutant of HIF-1α (P402A/P564A) and in the RCC/RCC+vhl model of endogenous HIF-1α stabilization. Moreover, hypoxia augmented mRNA levels of RIN2, RIN3 and ALS2; however, in RCC cells, endogenous stabilization of HIF-1α increased ALS2 mRNA levels, but not those encoding for any other GEFs. By western blotting, we showed that both hypoxia and endogenous stabilization of HIF-1α (RCC model) increase ALS2 protein levels, in a manner that depended on HIF-1α, as shown by siRNA and pharmacological approaches. Our ChIP experiments showed that HIF-1α binds to the putative HRE sequence (-782/-788 pb) in the promoter of ALS2. Finally, by siRNA-mediated targeting, we observed that ALS2 is necessary for Rab5 activation, cell migration and invasion under hypoxic conditions. DISCUSSION. In this work, we demonstrated that hypoxia and HIF-1α promote the expression of the Rab5-GEF ALS2, which is necessary for Rab5-GTP loading, tumor cell migration and invasion induced by hypoxia. Also, we report for the first time that HIF-1α binds directly to the ALS2 promoter in A549 tumor cells, representing the first link between ALS2 and the maintenance of characteristics associated with tumor malignancy induced by hypoxia via HIF-1α.