Aislamiento y secuenciación del genoma de un aislado chileno de grapevine fanleaf virus. Expresión del gen de la cápside y producción de anticuerpos policlonales con fines de inmunodiagnóstico

Abstract

Grapevine fanleaf es una de las más importantes y diseminadas enfermedades de la vid causadas por el GFLV (virus de hoja en abanico de la vid). El genoma de GFLV está compuesto de dos fragmentos de ARN de hebra simple de sentido positivo. El ARN1 codifica para todas las proteínas requeridas en la replicación y por su parte, el ARN2 lo hace para proteínas requeridas en el ensamblaje y movimiento del virus. Chile, un importante productor de vino y uva de mesa, es afectado por este problema. Es por ello, que la detección de virus que infectan vides es necesaria en programas de mejoramiento sanitario en el cual el propósito es la propagación de material de plantas libres de virus. En base a lo anteriormente descrito, en esta tesis realizamos el análisis molecular de distintos aislados de GFLV, de las regiones Metropolitana, V y VI de Chile. Se obtuvo ARN viral, el cual fue clonado en bacterias luego de su amplificación por RT-PCR. Con ello se logró obtener la secuencia completa del genoma de GFLV Ch 80 y de zonas de interés de los otros aislados. Comparaciones de las secuencias obtenidas muestran una identidad de 90% a nivel de nucleótidos y 93% a nivel de aminoácidos. La proteína de cubierta viral (CP Ch-80) se clonó y expresó en dos fragmentos (CP Ch-80α y CP Ch-80β) en E.coli. Posteriormente estas proteínas se purificaron y utilizaron en el desarrollo de anticuerpos policlonales. Como una segunda estrategia, se diseñaron péptidos sintéticos en base a la secuencia de CP Ch-80 obtenida en nuestro laboratorio, los cuales se inyectaron en conejos para la elaboración de anticuerpos policlonales contra GFLV. Se evaluó la respuesta inmune a los anticuerpos obtenidos mediante ELISA y Western blot. Los resultados obtenidos demuestran que los anticuerpos reconocen la proteína recombinante. Además se realizaron análisis preliminares de inmunocaptura viral (IC-RT-PCR) con plantas infectadas con GFLV los cuales reafirman estos resultados.

Grape fanleaf is one of the most important and widespread grape disease caused by GFLV (Grapevine Fanleaf Virus). The GFLV genome is constituted by two positive single strands RNAs. The RNA 1 encodes for all the proteins involved in replication and RNA 2 encodes for proteins required for virus assembly and movement. Chile, an important wine and table grape producer, is affected by this problem. Therefore, the detection of virus that infects grapevines is needed in programs of sanitary improvement in which the purpose is to propagate virus-free plant material. Based on this, we analyzed molecularly the different GFLV isolates from regions V, VI and Metropolitan of Chile. We obtained viral RNA that was cloned in bacteria after amplification by RT-PCR. We obtained the full genome sequence of GFLV Ch-80 and partially sequenced regions of other Chilean isolates. Sequence comparison showed a nucleotide identity of 90% and amino acid identity of 93%. The coat protein (CP Ch-80) was cloned and expressed in E. coli in two fragments (CP Ch-80α and CP Ch-80β). Then, these proteins were purified and used to develop polyclonal antibodies. As a second strategy, synthetic peptides designed based on the CP Ch-80 sequence obtained in our lab, were injected into rabbits to develop polyclonal antibodies against GFLV. The immune response of the antibodies was evaluated by ELISA and Western blot. The results obtained showed that the antibodies recognize the recombinant protein. In addition, preliminary analysis of infected plants with GFLV by means of immunocapture (IC-RT-PCR) confirmed these results