Caracterización bioquímica de las enzimas recombinantes aldosa-6-fosfato reductasas (NADPH) AtA6PR1 y 2, de Arabidopsis thaliana

Abstract

Las plantas de la familia Rosaceae producen sorbitol durante la fotosíntesis. Este es un alcohol de azúcar sintetizado por la aldosa 6-fosfato reductasa (A6PR) a partir de glucosa 6-fosfato en conjunto con la oxidación de NADPH, y luego translocado por el floema hacia órganos sumideros para ser oxidado a fructosa por la sorbitol deshidrogenasa (SDH), la cual posteriormente es almacenada o utilizada. Sin embargo, se ha reportado que plantas que no pertenecen a la familia Rosaceae y que translocan sacarosa como principal fotosintato poseen enzimas que metabolizan sorbitol. Es el caso de Arabidopsis thaliana, planta herbácea de la familia de las Brassicaceae, que posee las enzimas SDH y A6PR. Esta última, correspondería a la enzima clave de la ruta de síntesis de sorbitol, y se ha encontrado que en Arabidopsis existen 2 marcos de lectura que codifican proteínas con una identidad aminoacídica de > 65% con A6PR conocidas. Ambas proteínas, denominadas AtA6PR1 y AtA6PR2, poseen las características moleculares de proteínas clasificadas dentro de la familia de las aldo-ceto reductasas. Ambos genes se expresan ubicuamente en toda la planta, donde AtA6PR1se expresa aproximadamente unas 100 veces más que AtA6PR2, y responden diferencialmente frente a estrés abiótico (frío o salinidad). Por otro lado, se ha estudiado la localización subcelular de ambas proteínas (proteína fusionada a GFP), siendo estas citosólicas. Sin embargo, no se ha determinado la actividad enzimática de ambas reductasas. En esta Tesis de Magíster, se optimizó la secuencia génica de AtA6PR1 y AtA6PR2 para su expresión en el organismo heterólogo Escherichia coli,y se construyó y comprobó la funcionalidad de dos vectores de expresión (pDEST17 y pDEST-HisMBP) portadores de los genes vegetales optimizados. Adicionalmente, se realizó una primera aproximación a la caracterización enzimática de ambas proteínas, obteniendo una actividad enzimática parcial para HisMBP-AtA6PR1, sugiriendo que efectivamente es capaz de reducir glucosa 6-fosfato en presencia de NADPH.

Plants in the Rosaceae family produce sorbitol during photosynthesis. This is a sugar alcohol synthesised by aldose 6-phosphate reductase (A6PR) from glucose 6-phosphate combined with the oxidation of NADPH, which is then translocated by the phloem to sink organs to be transformed into fructose by sorbitol dehydrogenase (SDH), which is stored or used. However, it has been reported that plants that do not belong to this family and that translocate sucrose as the main photosynthate possess enzymes that metabolise sorbitol. This is the case of Arabidopsis thaliana, aherbaceous plant of the Brassicaceae family, which has the enzymes SDH and A6PR. The latter corresponds to the key enzyme of sorbitol synthesis, and in Arabidopsis, there are 2 open reading frames encoding proteins with >65% amino acid identity with known A6PR. Both proteins, called AtA6PR1 and AtA6PR2, possess the molecular characteristics of proteins classified within the aldo-keto reductase family. Both genes are ubiquitously expressed throughout the plant, where AtA6PR1 is expressed approximately 100 times more than AtA6PR2, and they respond differentially to abiotic stress (cold or saline). Moreover, the subcellular localisation of both proteins (protein fused to GFP) has been studied; both are cytosolic. However, the enzymatic activities of both proteins have not been determined to date. In this Master's thesis, the gene sequences of AtA6PR1 and AtA6PR2 were optimised for expression in the heterologous organism Escherichia coli, and the functionality of two expression vectors (pDEST17 and pDEST-HisMBP) carrying the optimised plant genes was tested. In addition, both proteins were partially characterised enzymatically, suggesting that HisMBP-AtA6PR1 is indeed capable of reducing glucose 6-phosphate in the presence of NADPH.