Fasudil, un inhibidor de rock, previene las alteraciones conductuales producidas por estrés de restricción de movimiento en un modelo animal de depresión

Abstract

El estrés psicosocial está relacionado con patologías psiquiátricas como la depresión, la cual se caracteriza por el deterioro cognitivo y trastornos morfológicos como el acortamiento de espinas dendríticas y la simplificación de ramificaciones dendríticas. Estos cambios implican probablemente alteraciones en el citoesqueleto, el cual está compuesto principalmente por microtúbulos y actina. La GTPasa pequeña Rho es un importante regulador de la dinámica de actina y uno de sus efectores es la quinasa ROCK (Rho associated, coiled coil kinase). La transfección de neuronas piramidales del hipocampo con formas mutantes constitutivamente activas de ROCK produce simplificación de la arborización dendrítica y reducción en la densidad de espinas. Por lo tanto, proponemos que un inhibidor de ROCK, como fasudil, podría prevenir las alteraciones conductuales observadas en modelos animales de depresión, lo que debería correlacionarse con las modificaciones morfológicas propias del estrés. Ratas macho adultas Sprague-Dawley (240-260 g) fueron divididas en cuatro grupos experimentales: control/solución salina (C/SAL), control/fasudil (C/FAS), estrés/ solución salina (S/SAL) y estrés / fasudil (S/FAS). El tratamiento con fasudil (10 mg/Kg) o solución salina se administró i.p. comenzando cuatro días antes del procedimiento de estrés de restricción, el cual se llevó a cabo por 2,5 horas/día durante 14 días. Con el fin de observar síntomas asociados a la depresión promovidos por el estrés y su prevención por fasudil, llevamos a cabo la prueba de natación forzada y la de evitación activa. Los animales estresados mostraron un mayor tiempo de inmovilidad que los controles y fasudil previene este efecto al incrementar el tiempo de escalamiento, lo que sugiere un aumento del tono noradrenérgico. Además, los animales estresados mostraron una reducción en la adquisición de respuestas condicionadas con el consiguiente aumento en las fallas en el escape, lo que indica un deterioro del aprendizaje asociativo y de la memoria. Todos estos efectos fueron prevenidos por fasudil. Por otro lado, los animales control tratados con fasudil no mostraron alteraciones de la conducta. Con el fin de evaluar los efectos bioquímicos producidos por el estrés y el tratamiento con fasudil, nos centramos en las vías RhoA/ROCK/LIMK siendo esta ultima una quinasa que fosforila a cofilina promoviendo la polimerización de actina y RhoA/ROCK/MCL; MLCP, que regulan la dinámica de actina. Los resultados indicaron que el estrés no produce alteraciones en los niveles y cuantía de la fosforilación en las proteínas analizadas. En cambio, el tratamiento de los animales sometidos a estrés con fasudil, muestra una tendencia al incremento en los niveles de RhoA sin variación en el estado de fosforilación de LIMK y cofilina. Por otro lado, la administración de fasudil a animales controles promueve una tendencia al aumento en LIMK fosforilada que se correlaciona con un leve incremento en los niveles de cofilina fosforilada en el mismo grupo experimental, sugiriendo una relación de causalidad entre ambas proteínas. Estos resultados sugieren que en los animales controles tratados con fasudil, se observa la activación de señales compensatorias que promueven la activación de la vía LIMK/cofilina. Esto conduciría a la polimerización de actina y probablemente a la aparición de espinas. Por otro lado, queda por determinar si el estrés promueve vías asociadas al acortamiento o desaparición de espinas comandada por la actividad de ROCK/MCL; MLCP, y si estos cambios son prevenidos por el tratamiento con fasudil, en desmedro de la actividad de la otra vía en estudio. Esto explicaría la razón por la cual no hubo alteraciones en los niveles de p-cofilina ni en p-LIMK en ratas sometidas a estrés

Psychosocial stress is related with psychiatric pathologies like depression, which is characterized by cognitive impairment and morphological disruptions like dendritic spines shortening and dendritic branching simplification. These changes imply alterations on the dendritic cytoskeleton, which is composed principally by microtubules and actin. Rho is an important regulator of actin dynamic, and one of its effectors is ROCK (Rho associated, coiled coil kinase).Transfection of hippocampal pyramidal neurons with constitutively active ROCK mutant produces dendritic simplification and reduction in dendritic spines density. Thus, we propose that a ROCK inhibitor, like fasudil, may prevent depressive-like behaviour induced by stress, which should correlate with stress- related morphological alterations. Adult male Sprague–Dawley rats (240–260 g) were divided in four experimental groups: control/saline (C/SAL), control/fasudil (C/FAS), stress/saline(S/SAL) and stress/fasudil S/FAS). Fasudil treatment (10 mg/Kg) or saline were administrated i.p., starting four days prior restraint stress procedure, which was conducted 2.5 hrs/day during 14 days. In order to observe depression-like symptoms promoted by stress and their prevention by fasudil, we carried out the forced swimming test and the conditioned avoidance test. Stressed animals showed a higher time spent in immobility than controls. Fasudil prevents this effect by increasing the time spent climbing, suggesting an increase in noradrenergic tone. In addition, stressed animals showed a reduction of conditioned avoidance responses, with a concomitant increase in escape failures, indicating an impairment of associative learning and memory. All these effects were prevented by fasudil. On the other hand, control animals treated with fasudil did not show any behavioral alterations. In order to evaluate biochemical effects produced by stress and fasudil treatment, we focused on the RhoA/ROCK/LIMK pathway, which last kinase (LIMK) phosphorylates to cofilin, promoting actin polymerization and RhoA/ROCK/MCL; MLCP, which regulates actin-myosin contraction. The results indicated that stress does not produce changes in levels of phosphorylation of analysed proteins. However, stressed animals which received fasudil treatment, show a trend to increase RhoA levels, without changes in phosphorylation state of LIMK and cofilin. On the other hand, fasudil administration to control animals promotes a trend to increase p-LIMK, which is correlated with a small increase in p-cofilin levels in the same experimental group, suggesting a causality relationship between them. These results suggest that control animals treated with fasudil show adaptative signals, which promote activation of LIMK/cofilin pathway. It is probable that the activation of this pathway conducts to actin polymerization, hence promoting spines formation. On the other hand, it remains to be determined whether or not stress triggers the activation of pathways associated with the shortening or disappearance of spines through the ROCK/MLC; MLCP pathway. Furthermore, it could be important to determine whether these changes are prevented by fasudil, decreasing the activity of the ROCK/LIMK/cofilin pathway. This could explain why no alterations were found on p-cofilin and p-LIMK levels in stressed rats