Estudio de la metilación del factor de elongación ef-tu en microorganismos

Abstract

El factor de elongación EF-Tu es una de las proteínas más abundantes tanto en las c é l u l a s p r oc art ón t i c a s como eucariónticas. Este factor tiene una función clave en la traducción al promover la unión del aminoacil-tRNA, dependiente de GTP, al sitio A del ribosoma durante el ciclo de elongación de la biosfntesis de protefnas. Este factor no sólo es interesante por su importante función bio16gica sino que t arnb i é n por la diversidad de moléculas con las cuales i n t e r ac t á a , Entre ellas se cuentan el aminoacil-tRNA, el GTP, GDP, el factor de elongación EF-Ts, los antibi6ticos kirromicina y pulvomicina y algunos componentes ribosomales. Además se ha descrito que esta protefna es metilada tanto en Escherichia col i como en Salmonel1a typhimurium. Esta modificaci6n se encuentra s610 en la 1 isina-56, en E. col i, pudiendo ser mono- o dimetill isina. Sin embargo, actualmente no se con oc e 1 a funci6n de '2'sta modificaci6n post-traduccional del EF-Tu. En este trabajo hemos abordado el estudio de algunos aspectos de la metilaci6n del factor de elongación EF-Tu en diversos organismos. Encontramos que tanto el EF-Tu de c l or op l a s t o s de Euglena gracilis como posiblemente el factor de la bacteria termof f 1 i c a Ba.c i 11 U5 stearotherrnoph i 1 us son me ti 1 ados. En cambio en el EF-Tu de Bacil1us subtilis no fue posible establece~ la p~esencia de aminoácidos metilados. Los ~esultados obtenidos con el EF-Tu de clo~oplastos constituyen o t r a c ar-ac t e r I s t l c a de tipo b ac t e r-I an o p ar a el ap ar a t o t r aduc c i on a l de estos or-qane l o s , 10 que apoya la hipótesis de su posible o~igen endosimbiótico. Estos estudios compa~ativos y los de ot~os auto~es nos ¡ndica~on un eie~to g~ado de conse~vaei6n para la metilaeiÓn del facto~ de elongación EF-Tu en algunas bacte~ias y en los clo~oplastos, 10 que sugie~e un posible papel de impo~tancia pa~a 1 a me t i 1 a e i ón de las p~otefnas del apa~ato t r aduc c i on a l , Se cíe s ar-r o l l ar-on dos sistemas de metilación in v i tr-o del facto~ de elongaeión EF-Tu. El p~ime~o, consistió en un sistema dependiente de DNA, en metionina-35S o S-Ado(metil-3H)Met ).rifd18, el cual tiene el gen tufB el y que se utilizó el DNA del fago que codí f j ea p ar-a el + ac t or- EF-Tu de E. coli. En este sistema se obtuvo p orp~ ime~a vez la síntesis y la metilación del EF-Tu, en fo~ma ef i c. i en te, encon t~ándose mono- y di me ti 11 i si n a , El segundo sistema desarrollado empleó como sust~ato el EF-Tu submetilado a~tíficialmente. Pa~a el lo se c~ecie~on las c é l u l a s de E. col i en un medio en que la metionina se encont~aba 1 imitante, o en un medio mfnimo suplementado con etionina, en reemplazo de la metionina. Como dador de g~upos metilos se utiliz6 S-Ado(metil-3H)Het. Con estos sistemas también se obtuvo la metilaci6n del EF-Tu, encontrándose mono- y dimetillisina. Estos resultados sugier'en que en todos los sistemas de metilaci6n in vitro desarrollados, el factor EF-Tu se metilarfa como in vivo. Mediante estos sistemas, pusimos en evidencia además de la metilación in vitro del factor EF-Tu de cloroplastos de E. gracilis, la presencia de una enzima metiltransferasa de EF-Tu tanto en E. col ¡ como en los cloroplastos. Esta actividad metiltransferasa resultó ser altamente inestable y no fue posible purificar la enzima, por 10 que se caracterizó en forma prel iminar sólo en extractos crudos de E. col i . El grado de metilación in vivo del factor EF-Tu de E. coli varió en las distintas etapas del crecimiento de la bacteria, alcanzándose la máxima incorporación de grupos metilo hacia la mitad de la fase logarftmica de crecimiento. Estos resultados nos sugirieron una posible función biológica para la modificación post-sintética del factor. Con el prop6sito de estudiar la posible función de la metilación en la estructura o actividad del EF-Tu se compararon algunas propiedades de preparaciones altamente purificadas del EF-Tu metilado (EF-TuL), obtenido de E. col i LBE1001 crecidas hasta la fase estacionaria t ar d í a de la cu~va de c~ecimiento, y de dos p~epa~aciones de EF-Tu submetilado: EF-TuM, obtenido de E. coli MRE600 c r-e c i da s hasta la mitad de la fase logarftmica y EF-TuE, obtenido de c~lulas crecidas en presencia de etionina. Cuando el factor EF-TuL, metilado, menor velocidad se t~at6 con comparado con los facto~es submetilados de de gr adac i ón EF-TuM y EF-TuE. tripsina, presentó una Estos resultados sugieren que la metilaci6n de la 1 isina-56 del EF-Tu, que se encuentra en una regi6n expuesta de la mol~cula, p~otegerfa a la protefna del ataque p~oteolftico. Al medir la velocidad de disociaci6n de los nucle6tidos GDP y GTP en las distintas p r-e p ar ac i on e s de EF-Tu, ésta pareci6 no estar efectada por la metí 1aci6n. Sin embargo, 1 a ac ti v i dad GTPasa, que presen t a el EF-Tu estimulada por aatRNA en presencia de k i r-rom i c i n a , se encontr6 signifivativamente aumentada cuando el EF-Tu estaba me ti 1 ado. Este efecto de la metilaci6n sobre la actividad GTPasa del EF-Tu p odr J a t e n e r- una i mp cr t an c i a fisiol6gica p ar a la bacte~ia, ya que la actividad GTPasa está d¡~ectamente cor~elacionada. con la fidel idad en el proceso de traducci6n mediado por los ribosomas.

The elongation factor EF-Tu is one of the most abundant cellular proteins in both prokaryotic and eukaryotic cel1s. This factor plays a central role during translation by pr-omoting the GTP-dependent binding of aminoacyl-tRNA to the A site of t h e ribosomes during the elongation c vc l e of protein biosynthesis. In addition, this p ro t e l n factor is i n ter e s t i n 9 be c a u s e ¡ti n ter a c t s w i t h am i n o a e y 1 - t RNA , GT P , GDP, elongation factor EF-Ts, the antibiotics kirromycin and pulvomycin and some components of the ribosome. The elongation factor EF-Tu has been found methylated in both Escherichia col and Salmonel1a typhimurium. This modification takes place in the lysine-56 in E. coli and it can be mono- or dimethyl1ysine. However, the function of this post-trans1ationa1 modification is at present unknown. In this work we have studied some a sp e c t s of the EF-Tu methylation in severa1 microorganisms. We found tha t both the EF-Tu from c h 1 orop 1 asts from Euglena gracilis and possibly the factor from the thermophil ic Bacillus stearothermophilus were methylated in vivo. However, we could not find methylated amino acids in the factor from Bacil1us subtilis. The simi lar- i ty between the r e su l ts obtai ned wi th the chlor-oplast EF-Tu and those with E. eol i suppor-t the possible endosymbiotic ,:)r-igin +or- the or·ganel1e. These compar-ative studies, together- with evidence fr-om o t h er- investigator-s, suggested some degr·ee of c on s er-v a t í on +or- the me t hv l a ti on of EF-Tu +r crn some eubac ter- i a an d +r om e h 1 or- op 1 a s t, i n di e a t i n gap oss i b 1 e i mp or- tan t r- o 1 e f or- t he methylation of pr-oteins fr-om the tr-anslational apparatus. We developed two in vitro systems to study EF-Tu methylation. The first was a DNA-dependent system employing 35S-methionine, S-Adenosyl(methyl-3H)Methionine and ~rifd18 DNA, coding +or- EF-Tu from E. eoli. With this system, we obtained +or- the first time, t he efficient synthesis arid methylation of EF-Tu, in which mono- and dimethyl1ysine were found. The second s v s t ern employed ar-tificial1y under-methylated EF-Tu, obtanied by gr-owing E. coli limiting methionine c on c e n t r-a t i on or- in the pr-e s e nc e ethionine instead of methionine. S-Ado(methyl-3H)Met at of was used as a methyl group donor. 8y using these systems, we found both mono- and dimethyl1ysine in EF-Tu. Therefor-e, the me t hv l a t i on of EF-Tu r-esembled that obtained in vivo with a l l the in vi tro systems developed. These in vitro systems were useful not only in showing the in vitro methylation of the EF-Tu from chloroplasts but al10wed us to confirm the presence of an EF-Tu me t h v l tranferase both in E. col i and ch 1 or op 1 asts from E. grac i 1 i s , However, the rne t h y l t ran s f e r a s e ac t i v i t x 1,\) a 0:' h i qh l » unstable and it was on l y p o s s l b l e to make a p r e l i m i n ar-v ch ar ac t e r-i za t i on by using c ru de e x t r ac t s from E. col i . Th e degree of in vivo me t hv l a ti on of EF-Tu changed during the growth phase of t h e b ac t e r-i a , having a maximun value towards the half of the 10garithmic growth phase these r-e su l t s o:;uggested a possible biological ro l e +or- the post-synthetic modification of EF-Tu. To study the possible effect of rne t hv l a t i on on the s t r-u c t ur-e or- +un c t i on of EF-Tu, we c omp are d some p rop e r-t i e s of highly purified methylated EF-Tu (EF-TuL) obtanied +rom E. col i LBE 1001 grown up to the 1 ate stat i on ar y growth phase and those of two undermethylated EF-Tu purified preparations: EF-TuM, from E. coli MRE 600 grown up to half of the logarithmic growth phase and EF-TuE, from cel1s grown in the presence 0+ ethionine. When the methylated EF-TuL was tested in the presence 0+ tryps in, i t s h owe d a grea t 1 y reduced degrada ti on ra te compared with the two undermethylated EF-Tu factors (EF-TuM and EF-TuE). These results suggested that the methylation OT the Lys-56 present in an exposed region of the EF-Tu molecule, would protect the protein from proteotytic attacK. The me thyl a ti on of EF-Tu ap p e ar-e d not to affec t the rate of GDP and GTP exchange. However, the aatRNA-stimulated GTPase ac ti vi ty rne a sur-e d in the p r e s e n c e of K i r-r omvc in, was greatly stirnulated when the EF-Tu was rnethylated. Th i s effect of methylation upon t h e EF-Tu GTPase activity could be physiologically important since the GTPase ac t i v i t v is directly correlated with the fidelity of the ribosome rnediated translation process.