Fitoestrógenos nutricionales como inductores de fenotipo epigenético en etapas tempranas del desarrollo en mamíferos

Abstract

La variación de caracteres entre individuos de una población es un tema central en la teoría darwiniana de la Selección Natural, aún cuando los procesos involucrados en el origen de estas variaciones han recibido menor atención. Desde una perspectiva evolutiva, el origen de una especialización al interior de un linaje puede ser una interrogante distinta a la de la mantención, una vez originada. En ese sentido, el desarrollo embrionario sería tendría una gran relevancia sobre el origen de la variación fenotípica viable y susceptible de ser seleccionada, en tanto la Selección N atural determinaría a continuación cuales de esas variantes pueden prosperar y mantenerse en la historia evolutiva. Por lo tanto, es posible centrarse en el estudio de los procesos que llevan al origen de la variabilidad fenotípica heredable sin la necesidad de conocer si las novedades que surjan estarán sujetas a posteriores procesos selectivos. No obstante, para estudiar el origen de las novedades morfológicas y las restricciones en el cambio fenotípico se requiere del conocimiento acerca de los procesos que dirigen el desarrollo. Cambios de base epigenética que ocurren durante el desarrollo han propiciado la aparición de grandes transformaciones morfológicas a lo largo de la historia evolutiva. Existen evidencias indicando que xenobióticos ambientales pueden interferir en el desarrollo embriológico temprano en los animales, lo que tendría consecuencias en el estado adulto. Durante el proceso embrionario el microambiente en el cual el feto se desarrolla es susceptible a influencias por parte de la madre y por lo tanto vulnerable a variaciones en el estado hormonal de ésta. Dicho estado hormonal puede ser profundamente alterado por el medio, a través de compuestos con acción estrogénica (CAEs). Los fitoestrógenos son CAEs que se encuentran en compuestos vegetales. Algunos de ellos, como daidzeína y genisteína, han sido encontrados en alimentos comunes en la composición dictaria natural de roedores. Se ha descrito en roedores, que cambios en el epigenotipo derivados de la exposición temprana a CAEs pueden ser transmitidos a las generaciones subsiguientes. Por ejemplo, se conoce que la exposición temprana (blastocistos en cultivo) a compuestos estrogénicos sintéticos como el bisfenol A, puede repercutir en rasgos en el adulto, como el peso. Incluso, se ha demostrado que la exposición in utero al dieti1estilbestrol (DES) puede producir una aumentada susceptibilidad a determinados tipos de tumores y mas aún, dicho aumento se pude transmitir transgeneracionalmente sin la necesidad de haber sido estimulada nuevamente por el DES. Dicha herencia podría deberse a la acción de los CAEs sobre la metilación del DNA. Si a estos hechos agregamos quc altas cantidades de fitoestrógenos dietarios pueden producir una considerable actividad estrogénica, comparable a la producida por DES, y que la exposición temprana en la ontogénia a fitocstrógcnos puede inducir a alteraciones morfológicas y en el patrón de metilaciones de proto-oncogenes, es factible inferir que en roedores, alteraciones en el estado hormonal de hembras preñadas producidas por el consumo de fitoestrógenos afectan: i) las señales en el ambiente intrauterino donde se desarrolla el embrión, y en consecuencia ii) el proceso de reestablecímiento de patrones de metilación de gene s en el embrión en desarrollo, lo que produce iii) alteraciones tanto en el fenotipo adulto resultante, como en ciertos caracteres de historia de vida de una población. Basado en lo anterior, el presente estudio evaluó en Mus musculus domesticus si CAEs de origen natural (fitoestrógenos dietarios, en este caso) actuando a través de la madre, podrían producir modificaciones epigenéticas en etapas tempranas del desarrollo, verificando además sus consecuencias en parámetros de historia de vida. Para ello, los roedores fueron sometidos a una dicta alta en fitoestrógenos ad libitum, conteniendo 2% de un extracto de isoflavonas de soja (Glycine max), alimento natural que presenta la mayor concentración conocida de los fitoestrógenos genisteína y daidzeína. Se evaluó si someter hembras de roedores preñadas al consumo de fitoestrógenos podría producir alteraciones en los patrones de metilación del ADN, específico en genes y general en el genoma, tanto en el embrión preimplantacional como en hígado y páncreas en adultos. Además, se estudió si el consumo de fitoestrógenos por parejas de roedores puede desencadenar diferencias morfométricas y en parámetros de la historia de vida en la descendencia. En Mus musculus existe evidencia de que estos rasgos se ven modificados cuando se someten roedores n~onatos a tratamiento con fitoestrógenos. Sin embargo, no existen estudios que demuestren este efecto en descendientes de hembras preñadas consumiendo altas concentraciones de fitoestrógenos. En este estudio, los roedores fueron sometidos a dos tratamientos, en los que se les suministró ad limitum una de las siguientes dietas: i) alimentación por comida alta en fitoestrogenos (Dieta ISF), compuesta por pellet para ratón con 2% de extracto comercial de isoflavonas, y ii) alimentación por comida baja en fitoestrogenos (Dieta Control), que consistió solamente en pellet para ratón. Se evaluó el efecto del consumo de una dieta alta en fitoestrógenos (2 % isoflavonas) por una población experimental de ratones, en tres ámbitos: i) fisiología intrauterina en madres, para lo cual se desarrolló una técnica para la determinación por HPLC de catecolestrógenos intrauterinos, cuya secreción podría verse afectada debido a un alto consumo de fitoestrógenos. ii) caracteres morfométricos y de historia de vida en la descendencia, para lo cual se evaluaron parámetros como peso, tamaño, distancia ano-genital y fecha de maduración sexual. iii) metilación de gene s en la descendencia (embriones y tejidos adultos) de madres sometidas a los tratamientos, para lo cual se midió metilación del ADN en los genes ce-actina y Receptor de Estrógeno a en adultos y en UNE (secuencia repetida) en embriones. En cuanto a resultados experimentales, en el ámbito ecológico-poblacional se observaron en las crías importantes variaciones en respuesta al consumo de altas cantidades de fitoestrógenos. Entre estas variaciones destacan la disminución en el peso en machos adultos (parámetro morfornétrico) y el adelantamiento de la maduración sexual en hembras (parámetro de historia de vida). En el ámbito molecular se observaron cambios en la metilación de sitios CpG en las crías, en respuesta al tratamiento con altas cantidades de fitoestrógenos dietarios. Los cambios fueron observados en adultos para el gen «-actina en hígado y páncreas, y para el gen ERa en hígado. Además, se observó reducción en mutaciones en dos sitios CpG en la secuencia repetida UNE en blastocistos de madres tratadas con una dieta alta en fitoestrógenos. Por 10 tanto, agentes ambientales como los fitoestrógenos, actuando en etapas claves de la ontogenia pueden inducir alteraciones tan importantes como i) en parámetros epigenéticos como la metilación del DNA en genes específicos, ii) en parámetros de historia de vida que pueden repercutir profundamente en la estructura de una población, como la edad de maduración sexual, y iii) en parámetros morfométricos como el peso animal adulto, lo que podría tratarse de un efecto epigenético asociado a genes parentalmente marcados (GPM) o solamente a un efecto fisiológico relacionado con la conversión de hormonas o la suplantación del estimulo hormonal por fitoestrógenos. Estos resultados resaltan la importancia de dar mayor énfasis a los procesos evolutivos inductivos además de los procesos evolutivos restrictivos. Dentro de este enfoque, se enfatiza como los cambios evolutivos pueden surgir como respuestas organísmicas estructurales a estímulos ambientales específicos, que a su vez pueden actuar en ventanas temporales bien delimitadas durante la ontogenia, permitiendo dicha respuesta. Sin embargo, lo anterior no excluye la posibilidad de que estos cambios ambientalmente inducidos puedan transformarse a futuro en adaptaciones. Por otro lado, denota que el estudio de las adaptaciones y/o selección natural no es un tópico estrictamente necesario para el estudio de la evolución. Es innegable que la forma en como el ambiente restringe la estructura de un organismo juega un rol importante en la formación de este. Sin embargo, no menos importante es que la formación del organismo también ocurre por como el ambiente induce cambios en dicha estructura, mecanismo que debe tomarse más en consideración en estudios evolutivos

Variation in characters among individuals in a population is a central topic in the Darwinian theory of Natural Selectíon. Even more when the processes involved on the origin of such variations have received minor attention. From an evolutionary perspective, the origin of a specialization in a lineage may be treated as a different issue than of the maintenance of such specialization, once it is originated. In this sense, embryonic development would be the main responsible for the origin ofthe viable phenotypic variation and furthermore, capable to be selected. On the other hand, Natural Selection would then define which variant can prosper and perpetuate in evolution. Thus, it is possible to focus on the study of those processes leading to the origin of the heritable phenotypic variability without the need for knowing whether the novelties that eventually arise will be subjected to further selective processes. Nevertheless, to study the origin of the morphologic novelties and the restrictions on the phenotypic change it is required to know about the processes driving development. Epigenetic changes occurring during development have lead to significant morphological transformations along the evolutionary history. There are some evidenccs showing that environmental xenobiotics can interfere during early devclopment, which could have consequences on the adult stage. During the embryonic process, the microenvironment where the fetus develops is susceptible to influcnces from thc mother and therefore, also susceptible to changes in maternal hormonal state. Such hormonal state can be strongly influenced by thc cnvironment, through the action of compounds with estrogenic effects, Some of thosc compounds can be found in vegetables. These are called phytoestrogens, Somc phytoestrogens as daidzein and genistein can be naturally available for rodent consumption. It has been described in rodents that changes in the epigcnotype produccd after early cxposure to compounds with estrogenic action (CEA) can be transmitted to the subsequent generations. Such kind of heredity could be attributed to the action of such CEA on DNA methylation. In addition, there are evidcnces reporting that high amounts of dietary phytoestrogens are able to produce considerable cstrogenic activity, comparable to that produced by DES, and that early ontogcnctical cxposure to phytoestrogens can trigger morphologic alterations and on methylation pattcrns on proto-oncogenes, Based on that evidences, 1 proposed that in rodents, alterations in the hormonal state of pregnant females produced by the consumption of phytoestrogens (or other xenocstrogens) affect: i) the hormonal signaling in the intrauterinc environmcnt wherc embryo dcvelopmcnt takes place, which in turn have consequences on ii) the process of resetting of methylation patterns in the developing embryo, which produces alterations in both the resulting adult phenotype and in lifc history characters of a population. The present study evaluated in Mus musculus domesticus if natural CAEs (in the present case, dietary phytoestrogens), acting through the mother could be able to produce epigenetic modifications at early stages during development, verifying also the consequences on life-history parameters. The experimental approaeh to investigate it consisted of feeding adult rodents ad libitum with a diet high in phytoestrogens, containing 2% of a soy (Glycine max) isoflavones-extract. Soy is the food item presenting the higher known concentrations of the phytocstrogens genistcin and daidzein, It was cvaluated if such high maternal consumption of phytoestrogens could be producing ehanges in DNA methylation patterns in two specific gene s in the adult offspring, in liver and pancreas, or in general methylation along the genome in blastocysts. Morphomctric and life history characters were also evaluated in the offspring of mice couples subjected to control diet or the diet containing 2% isoflavone-extract. Previous evidence in Mus musculus shows that these traits are modified whcn subjecting neonatal rodents to treatment with phytoestrogens. Nevcrtheless, no studies have reported these effects on offspring from pregnant mothers fceding high amounts ofphytoestrogens. In thc present study, rodents werc assigned to one of the following experimental treatments: mice were fed ad libitum on i) control diet (chow diet for rodents), or on ii) control diet plus 2% soyisoflavones concentrate (ISF diet). The effect of the consumption of a diet high on phytoestrogens was assessed in an experimental population of mice. Threc levels of analysis were defined to evaluate the hypothesis. The experimental approach used in this thesis focused on: i) the physiological level on mothers, developing a technique capable of detecting and quantifying intrauterine catecholestrogens through HPLC, since secretion of these compounds could be affected by a high consumption of phytoestrogens; ii) the molecular level, measuring DNA methylation in thc offspring (blastocysts and adults) of mothers consuming high amounts of phytoestrogens, on genes o-Actin and Estrogen Receptor-a in adults and UNE repeated sequence in blastocysts; iii) the ecological level in the adult offspring, measuring morphometric and life-hístory characters, such as weight, size, ano-genital distance and timing of sexual maturation, in the offspring of mice couples subjected to control or ISF diet. With regard to the experimental results, in the ecological level important changes were detected in the offspring in response to the phytoestrogenic treatment, among them, reduction in size of adult males (morphometric parameter) and advancement of sexual maturation in females (life-history parameter). At the molecular level, changes in methylation in CpG sites were observed in the offspring in response to the phytoestrogenic trcatmcnt. Changes were detected in adults for ce-Actin gene in liver and páncreas, and for ER~ gene in liver. In addition, reduced mutations were observed in two CpG sites in UNE repeated sequcnce in blastocysts from mothers eonsuming high quantities ofphytoestrogens. Thus, environmental agents as phytocstrogens, acting in key stages during ontogeny are able to induce important alterations as: i) on epigenetic paramcters as gene specific DNA methylation, ii) on life-history characters that influences population structure, as timing of sexual maturation, and iii) on morphometric parameters sueh as adult weight, whieh may represent either an epigenetie effeet associated to Imprinted Genes, or to a physiological effect related to mimicking of hormonal stimuli by phytoestrogens. These results highlight the importance of giving more emphasis to inductive evolutionary processes in addition to restrictive evolutionary processes. This focus emphasises how evolutionary changes may arise as structural organismic responses to specific environmental stimuli, which can in tum act in very limited windows of time during ontogeny, making possible such a response. Nevertheless, the former do not exc1ude the possibility that such environmentally induced changes may be further transformed in adaptations. In parallel, such focus reinforce that the study of adaptations and/or natural selection is not a requirement for studying evolution. It is undcniable that the way in which the environment restricts the organism structure is fundamental for the shaping of it. Neverthcless, as important is how the environment induces changes that help to shape the organismo Such a mechanism should be more considered in studies of evolutionary biology