Papel del lazo s3-s4 y el segmento s3 en la activación del canal de k+ shaker

Abstract

Los canales de potasio dependientes del potencial, como el canal Shaker, son tetrámeros formados por subunidades de seis segmentos de transmembranales (S1-S6) (Shih y Goldin, 1997). En ellos, las "partículas cargadas" capaces de "sentir" el potencial a través de la membrana resultaron ser aminoácidos básicos (argininas ó lisinas) que se encuentran en el segmento S4, propuesto como el sensor de potencial (Liman y col., 1991; Papazian y col., 1991; Bezanilla y col, 1991; Perozo y col., 1994; Aggarwal y MacKinnon, 1996; Larsson y col., 1996; Mannuzzu y col., 1996; Seoh y col., 1996; Yang y col., 1996; Yussaf y col., 1996; Smith-Maxwell y col. 1998a y b; Díaz y col., 1998, Ledwell y Aldrich, 1999; Latorre y col, 2003). Sin embargo, aún no existe un consenso acerca de qué otros segmentos ó regiones, diferentes al S4, podrían estructurar al sensor de potencial, y cuál sería el mecanismo mediante el cual estos canales detectan los cambios de voltaje para su activación. Por ello, este trabajo estuvo dirigido a dilucidar el papel de regiones estructurales muy cercanas al S4, como el lazo S3-S4 y el segmento S3, en la activación del canal de K+ Shaker. Teniendo en cuenta que la distancia exacta que se mueve el sensor de potencial es desconocida, pensamos que movimientos grandes del segmento S4 deberían estar restringidos por la longitud del lazo S3-S4. Para comprobar esta hipótesis se construyeron mutantes de eliminación con lazos S3-S4 de diferentes largos, hasta la completa eliminación del mismo, así como mutantes sin lazo S3-S4 y con deleciones en el segmento S3b. Los resultados muestran que la eliminación total del lazo S3-S4 no afecta la probabilidad máxima de que los canales estén abiertos, y sin embargo, modifica a la mitad el número total de 13 cargas de compuerta para el canal Shaker, haciendo poco probable un desplazamiento muy grande (15 Å) para el segmento S4. Por otro lado, tanto las constantes de tiempo de la activación del canal Shaker, como el punto medio de las curvas de activación por potencial, varían periódicamente en función del largo del lazo. En mutantes con lazos de menos de 7 aminoácidos hacia el C-terminal, es posible demostrar que esta periodicidad es típica de una estructura de a-hélices. De ser esta región una continuación natural del segmento S4, esta sería una demostración indirecta de que el segmento S4 tiene una estructura en α -hélice. La eliminación del lazo S3-S4 y de parte del segmento S3b (desde leucina 327 hasta la isoleucina 360) origina una dramática disminución de la probabilidad máxima de encontrar los canales abiertos. Estas proteínas no son funcionales si se continúan eliminando los aminoácidos del segmento S3b. Sorprendentemente, la expresión ó funcionalidad de estos canales se vuelve a recuperar, cuando se ha eliminado el lazo S3-S4 y todo el S3b. Estos resultados indican que el segmento S3b no es vital para la activación del canal Shaker. Para el caso de los mutantes de eliminación del segmento S3b, encontramos también un comportamiento periódico entre las constantes de tiempo y la cantidad de aminoácidos presente en esta región de la proteína. Sin embargo, a diferencia de la periodicidad hallada hacia el C-terminal del lazo S3-S4, nosotros encontramos un punto de quiebre de dicho comportamiento periódico, en la treonina 329. Un resultado similar se encontró, al realizar la dinámica molecular de esta región por 1ns en H₂O. Dicho resultado apuntó no sólo a una coincidencia en el punto de quiebre de esta hélice (treonina329), sino que permitió comprobar que un medio acuoso, la hélice mantiene su estructura secundaria. Sorprendentemente coincidentes, fueron también los valores determinados para el ángulo de desfase (153°) entre ambas hélices, obtenido por la simulación de esta región, en relación al obtenido de los datos experimentales (158°). Por otro lado, a fin de dilucidar la posible participación del S3 como componente del sensor de voltaje en el canal Shaker, nosotros generamos mutantes con cisteínas ubicadas a todo lo largo del segmento S3b de diferentes largos de lazo S3-S4, y mutantes con cargas positivas en dicho segmento. Los estudios de sustitución por cisteínas en diferentes posiciones del segmento S3b, develaron una reactividad a MTSET, independientemente de la longitud del lazo S3-S4, y sin grandes diferencias de los valores de constantes de reacción, atendiendo al estado cerrado ó abierto del canal. Sin embargo, los valores de constante de reacción obtenidas fueron del orden de 1 mM-¹*s¹ diferentes en dos ordenes de magnitud al valor reportado para la reacción de MTSET con cisteínas libres. Este resultado nos permitió concluir que si bien, el MTSET es accesible hasta la posición 1-315 del canal, existe un impedimento estérico para la reacción del reactivo con las cisteínas del canal. Sobre la base de estos resultados, nosotros pensamos que esta región no está expuesta completamente hacia el lado extracelular, sino que se encuentra en el interior de la membrana formando una cavidad a la que el MTSET tiene acceso hasta la posición I-315. Este resultado fue corroborado al realizar un "docking" entre el MTSET y el S3b con cisteínas estructurado como una cavidad con grietas ó hoyos acuosos a los que accedió el reactivo hasta la posición I-315. Por último, el hecho agregar una carga positiva a la estructura del S3b (T326R) у no detectar cambios del número total de cargas de compuerta, durante la activación del canal, se interpreta como que el segmento S3 no se mueve. Por otra parte, nuestros resultados también apuntan a que el modelo de "remo ó paleta" propuesto para la primera estructura cristalina del sensor, en el caso particular del canal Shaker, es incorrecto. Nosotros concluimos que un modelo de desplazamiento muy pequeño para el sensor de voltaje, sin un papel protagónico ni para el lazo S3-S4, ni el segmento S3, sería el adecuado, durante la activación del canal de K+ Shaker.

Voltage-dependent K+ channels, as Shaker potassium channel, are protein tetramers each of which is formed by six transmembrane segments (S1-S6) (Shih and Goldin, 1997). In these channels, the "charged particles" that detect the electrical field changes, are basic aminoacids (arginines or lysines) forming part of the S4 transmembrane segments. These segments were proposed as voltage sensor (Liman et al., 1991; Papazian et al., 1991; Bezanilla et al, 1991; Perozo et al., 1994; Aggarwal and MacKinnon, 1996; Larsson et al., 1996; Mannuzzu et al., 1996; Seoh et al., 1996; Yang et al., 1996; Yussaf et al., 1996; Smith-Maxwell et al., 1998a and b; Díaz et al., 1998, Ledwell and Aldrich, 1999; Latorre et al., 2003). However, there is no consensus about other regions or segments, different from the S4 segment, which could also form part of the voltage sensor structure and be part of the mechanism that detects the electrical field changes, during activation of these channels. For this reason, this work was directed to evaluate the role of the structural regions, in close proximity to S4, as the $3-S4 linker and the S3 segment during the activation of Shaker K+ channels. Bearing in mind, that the exactdistance that the voltage sensor moves is not known, we think that a large displacement of S4 segment should be restricted by the length of the S3-S4 linker. To verify this hypothesis, we constructed mutants with different lengths of the S3-S4 linker, even the complete elimination of the linker, as well as mutants without the S3-S4 linker and further deletions in the S3b segment. The results show that the total elimination of the S3-S4 linker, does not affect the maximum open probability, nevertheless, the 13 total equivalents charges of Shaker K+ channels were reduced to half that number. These results suggest that a large displacement of the S4 segment is unlikely. On the other hand, both the activation time constant and the midpoint of the voltage activation curve of the Shaker K+ channel macroscopic currents becomes a periodic function of the S3-S4 linker length for linkers shorter than 7 aa residues. The periodicity is typical of an a-helix. If this region is a natural continuation of the S4 segment, would be a indirect evidence, that the S4 segment has an a-helix structure. The complete deletion of the S3-S4 linker and part of the S3b segment (from Leu-327 up to the Iso-360) produces a dramatic decrease of the maximum open probability of finding the channel open. These proteins turn into non functional channels if we continue eliminating aminoacid from the S3b segment. Surprisingly, the expression or functionality of these channels is recovered when both the S3-S4 linker and all of the S3b segment have been eliminated. These results indicate that the S3b segment is not essential for the activation of Shaker potassium channels. In the case of the S3b deletion mutants, we also find a periodic behavior between the activation time constants and the number of the aminoacids in this region of the protein. Nevertheless, unlike the periodicity of C-terminal of the S3-S4 linker, we find at treonine-329 a failure point in the periodic behavior. A similar result was obtained by molecular dynamics simulation of this region, in H₂O, and for 1ns duration time. This result pointed not only at a coincidence in the point of failure of the helix (treonine-329), but allowed to verify the secondary structure of the helix is not disrupted in water. Surprisingly coincidental, they were also the values determined for the angles (153°) between both helices, obtained by simulation of this region, in relation ship to the values obtained experimentally (158°). In order to explain the possible participation of the S3 segment as a component of the voltage sensor in Shaker channel, we generated single point cysteine mutants along the S3b segment having different lengths of S3-S4 linker. Another group of mutants with positive charges in this segment were contructed. The single cysteine substitution studies at different positions of the S3b segment, showed the same reactivity to MTSET, independently of the S3- S4 linker length, which little modifies the values of reaction constants, whether in the closed or open states of the channel. Nevertheless, the values of the reaction constants obtained were of the order of 1 mM¹*s¹. This value is two orders of magnitude different to the MTSET rate of reaction with free cysteine. This result allowed us to conclude that althoug MTSET is accessible up to position I-315 of the channel, there is steric hydrance for the reagent to react with the channel cysteine. Based on these results, we think that this region is not exposed completely towards the extracellular side, but this region is kept into the membrane, forming a cavity to which the MTSET has access up to the position I-315. This result was corroborated when a docking was perfomed between the MTSET and the cysteine of the S3b constructed as a cavity with cracks or watery holes to which the reagent acceded up to the position I-315. Finally, the fact of not detecting alterations of the total number of gating charges, during activation of the mutants, which had replaced the threonine 326 (located in the center of the S3b) by arginine, strongly suggests, that the S3 segment practically does not move. On the other hand, our results also are indicative that the paddle model proposed for the first crystalline structure of the sensor, is incorrect for the Shaker channel. We conclude that a model with a small displacement of the voltage sensor, without a leading role of the S3-S4 linker or the S3b segment, would be the suitable one, during the activation of the Shaker K+ channels.