Rol de células dendríticas inmaduras en la generación ex vivo de linfocitos T reguladores

Abstract

Los linfocitos T reguladores son importantes mediadores de la respuesta inmune debido a que mantienen la tolerancia a antígenos (propios y externos) y evitan el desarrollo de autoinmunidad al suprimir a los LT autorreactivos. Los mecanismos moleculares que llevan a la diferenciación a LT reguladores y su función son hoy un tema de extensa investigación. Fenotípicamente, esta población se caracteriza por la expresión constitutiva de CD25 (cadena a del receptor de IL-2), CD62L (L-selectina) y constituyen la única población descrita que expresa constitutivamente el factor de transcripción Foxp3, un gen clave en el desarrollo y función de estas células. Otros marcadores como CTLA-4 (antígeno 4 asociado a linfocito T citotóxico) y GITR (receptor relacionado con la familia- de los receptores de factor de necrosis tumoral inducido por glucocorticoides) también son expresados en esta población celular. Actualmente, numerosos estudios sugieren que los linfocitos T reguladores podrían ser utilizados en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, en la inducción de tolerancia a transplantes así como en alergias, en el tratamiento de inmunopatologías e inmunidad microbiana, lo que ha generado un fuerte interés por desarrollar metodologías que permitan aislar y expandir linfocitos T reguladores. Las células dendríticas son células presentadoras de antígeno profesionales, encargadas de capturar y procesar antígenos e iniciar la respuesta inmune primaria. Este proceso es dependiente del estado de maduración de la célula dendrítica de manera tal que si el antígeno es capturado en un contexto inflamatorio (como por ejemplo, una infección microbiana), esta célula entra en la fase terminal de maduración activando linfocitos T vírgenes para convertirlos en linfocitos T efectores. Por otra parte, si el antígeno es captado en ausencia de señales inflamatorias, la célula dendrítica permanece en un estado inmaduro y genera una respuesta tolerogénica favoreciendo la expansión de linfocitos T reguladores en lugar de linfocitos T efectores. Esta memoria de título tiene por objetivo desarrollar, en un modelo murino, una metodología para la preparación de linfocitos T reguladores ex vivo mediante el cocultivo de linfocitos T vírgenes con células dendríticas inmaduras y evaluar el fenotipo de estas células y funcionalidad de estas células en ensayos de supresión. Nuestros resultados indican que al día 4 del cocultivo de células dendríticas inmaduras derivadas de médula ósea de ratón con linfocitos T vírgenes se obtiene una población de linfocitos T CD4+ (80%), de los cuales el 91% es doble positivo para los marcadores de linfocitos T reguladores CD25*CD62L*. Además, éstas células expresan el RNA mensajero para el factor de transcripción Foxp3 determinado por RT-PCR. Este fenotipo es adquirido exclusivamente en el cocultivo con células dendríticas del tipo inmaduro. La funcionalidad de esta población de linfocitos T reguladores se evaluó mediante un ensayo de supresión in vitro. Los resultados indican que estas células suprimen la proliferación de linfocitos T efectores de una manera dependiente de la dosis de linfocitos T reguladores presentes en el ensayo. Además detectamos en el sobrenadante de los ensayos de supresión, altas cantidades de IL-10, una citoquina con propiedades anti-inflamatorias,. Sin embargo, los sobrenadantes de estos ensayos no detienen la proliferación de linfocitos T efectores, sugiriendo que los linfocitos T reguladores suprimen por un mecanismo dependiente de contacto celular. Finalmente, demostramos que los linfocitos T reguladores generados ex vivo específicos para un antígeno dado, son capaces de suprimir la proliferación de linfocitos T efectores en respuesta a otro antígeno sí y sólo si los linfocitos T reguladores son previamente activados con su antígeno especifico. Esto indica que la activación del linfocito T regulador es un proceso dependiente del antígeno, pero que su capacidad supresora no lo es. En síntesis, nuestros resultados muestran que linfocitos T vírgenes cocultivados con células dendríticas inmaduras en presencia de un antígeno específico, se convierten en una población homogénea de linfocitos T reguladores que poseen actividad supresora. El sistema desarrollado en esta memoria de título, trasladado al sistema humano, podría ser usado en el tratamiento de enfermedades autoinmunes y en la inducción de tolerancia a trasplantes.

Regulatory T cells are important mediators of the immune system because they maintain tolerance to self and foreign antigens and prevent the risk of autoimmunity through the suppression of autoreactive T lymphocytes. The molecular mechanisms leading to the differentiation of regulatory T cells and their function are nowadays unknown. These cells show constitutive expression of CD25 (a chain of IL-2 receptor), CD62L (L-selectin), and they constitute the only cell population expressing the transcription factor Foxp3, a master gene involved in the development and function of these cells. In addition, this population expresses CTLA-4 (Cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4) and GITR (Glucocorticoid-Induced Tumour-necrosis factor Receptor family-related gene). Nowadays, several studies suggest that regulatory T cells could be used in the treatment of autoimmune diseases, in the induction of tolerance to transplants and allergies, and in the treatment of immunopathologies and microbial immunity. Thus, there is a great interest in the development of new techniques to isolate and expand regulatory T cells. Dendritic cells are professional antigen presenting cells that, depending on their maturation state, can induce tolerance or immunity. In this context, if the antigen is captured in an inflammatory context, dendritic cell will enter into a state as terminal maturation activating naïve T cells and converting them into effector T cells. On the other hand, if the antigen is captured in a non-inflammatory context, dendritic cells will remain in an immature state generating regulatory T cells. In this thesis we have developed a method for the preparation of murine regulatory T cells ex vivo through the coculture of naïve T cells with immature dendritic cells and specific antigen. The phenotype of these cells was evaluated together with their functionality in suppression assays in vitro. Our results show that we obtained a population of CD4 T cells (80%) of which a 91% is double positive for the regulatory T cells markers CD25*CD62L* at day 4 of coculture. In addition, these cells express the mRNA for the transcription factor Foxp3, determined by RT-PCR. The functionality of the regulatory T cells was evaluated through a suppression assay in vitro. The results indicate that these cells suppress effector T cells proliferation in a dose dependent manner. Also, we detected in the supernatants of the suppression assays, high amounts of IL10, a cytokine with anti-inflammatory properties. However, supernatants obtained from suppression assays were unable to suppress the proliferation of effector T cells, suggesting that intercellular contact is a requirement for the suppressive mechanism. Finally, we demonstrated that regulatory T cells generated ex vivo specific for one antigen suppress the proliferation of effector T cells in response to another antigen. This bystander suppression occurs only when these regulatory T cells are activated with their own antigen. This suggests that the activation of regulatory T cell is an antigen-dependent process while their suppressive activity is not. This mechanism has enormous potential for clinical application. In synthesis, these results demonstrate that through cocultures with immature dendritic cells, naïve T cells can be converted in a population of regulatory T cells with suppressive activity. This system if applicable to the human model, could be used in induction to tolerance to transplants and in the treatment of autoimmune diseases.