Estudio sobre la expresión de oxidasa alternativa en yemas de vid cv. Thompson seedles durante el período de eco y endodomancia

Abstract

Vitis vinifera cv. Thompson Seedless es un frutal caduc¡fol¡o, lo que s¡gn¡f¡ca que alterna per¡odos de crecimiento con periodos de latencia. Durante el periodo de desarrollo, y. vinifera genera estructuras llamadas yemas que permanecen en un estado de dormanc¡a hasta la temporada siguiente, brotando durante la primavera reíniciando el crecimiento. En V. vinifera cv. Thompson Seedless cultivadas en zonas subtropicales, como el Valle del Elqui en Chile, se observa una anomalía en la brotación caracterizada por una brotación escasa y dispareja. Esta brotac¡ón errát¡ca se ha relacionado con una falta de frío invernal en las zonas subtropicales que tendría como consecuencia un alargamiento de¡ período de endodormanc¡a de las yemas. Observaciones recientes indican que en el Valle del Elqui no se produce un alargam¡ento del período de la ED en yemas de Thompson Seedless, por lo que la brotación errática de las yemas en la primavera se debe a otra causa. Al comparar las horas frío acumuladas durante la temporada invernal en el valle de Elqui con las del valle del Maipo no se observan diferencias. Sin embargo, en Elqui se observan temperaturas máximas extremadamente altas durante los meses de Junio y Julio. Estas altas temperaturas invernales podrían afectar la respiración m¡tocondr¡al de las yemas dormantes, provocando una alterac¡ón en el estado redox del tejido lo que llevaría a un estrés oxidativo de las yemas que provocaría el fenómeno observado en Elqui. La Oxidasa Alternativa (AOX) es una ubiquinol oxidasa, ubicada en la membrana interna de la m¡tocondria de plantas, que entrega los electrones cedidos por el ubiquinol directamente al oxÍgeno para formar agua sin aumentar el gradiente transmembrana de protones, produciendo de este modo un bypass en el flujo de la cadena transportadora de electrones mitocondrial (CTE). Debido a esta actividad se han propuesto varias funciones a la AOX, entre las que se destacan: Termogénes¡s, control de la eficiencia del metabolismo m¡tocondrial y el control de la producción de especies reactivas de oxÍgeno (ROS) en la mitocondria. Se han descrito dos familias de AOX en plantas -Aox1 y Aox2- que se diferencian principalmente en la regulación de su expresión. Mientras que la familia Aoxl se expresa por diferentes estímulos amb¡entales, la expres¡ón de la fam¡lia Aox2 depende del tejido y estado de desarrollo. En este trabajo se diseñaron partidores específicos para dos de las cinco secuencias de transcritos asignados como AOX en la base de datos de Genomic Facilities de la UCLA. La expresión de dichos transcriptos se estud¡ó Ia en yemas de Thomposon Seedless colectadas en los valles de Elqui y Maipo. Adicionalmente, se estud¡o el efecto de las bajas temperaturas y la Azida de Sodio, un veneno m¡tocondrial, sobre la expresión de los transcritos de AOX en yemas endodormantes. Los resultados mostraron que la expresión los dos transcr¡tos de AOX, AOX23 y AOX53 es inducida por dist¡ntos factores, mientras AOX23 es inducido por frío, AOX53 es inducido por tratamientos con Az¡da de Sodio. A med¡ados de Jul¡o, se observo que los dos transcr¡ptos se expresaron en yemas colectadas en el valle de Maipo, mientras que en las yemas colectadas en el valle de Elqui solo uno de los transcritos se expresó.

Vitis vinifera cv. Thompson Seedless is a caducifolious fruit tree, wh¡ch means that alternates grow¡ng and recess per¡ods during their l¡fe cycle. Latent buds are produces during y. vinifera development, which remains in a dormancy stage till the next season sprouting in the spring and rein¡t¡at¡ng growth. ln Thompson Seedless grown in subtropical areas such as the Elqu¡ valley in Chile, anomalous sprouting of buds is observed during spring, which is characterized by few and uneven bud break. This erratic bud break has been related to the lack of chilling in subtropical regíons, which has been thought that extends the duration of the bud-ED period. Recently, it has been shown that duration of bud-ED is not longer in buds of Thompson Seedless grown in Elqui than in Maipo valley. Therefore, others reasons must ex¡st that explain the erratic bud break observed in buds grown in Elqui. Comparison of chilling hours accumulated during the fall winter season ¡n Elqu¡ and in Maipo showed no differences. However, in Elqui maximum temperatures during June and July are extremely high. This high maximum winter temperature could affect mitocondrial respiration of endodormant buds caus¡ng a disruption in the redox state of the tissue which ¡n turn could provoke an oxidative stress that could explain the erratic bud break observed in Elqui. Alternative oxidase (AOX) is an ubiquinol oxidase found in the internal membrane of plant mitochondria. The AOX takes the ubiquinol electrons and directly g¡ves ¡t to molecular oxygen to makes water, without increasing the transmembrane proton gradient. ln th¡s way, the AOX make a bypass in the mitochondrial electron transport chain flux. For this activity some function has been proposed for the AOX, the more important are: thermogenesis, mitochondrial metabolism efficiency control and m¡tochondr¡al product¡on of Reactive Oxygen Species (ROS) control. ln plant two families of AOX proteins -AOX1 and AOX2- has been described. The maín difference between these two families is the regulation of the expression. Expression of AOXI family is controlled by environmental st¡mulus, and AOX2 express¡on depends on the type tissue and on the developmental stage. ln this work, we designed specific primers for two AOX (AOX23 and AOX53) of ihe five sequences ot V¡tis vin¡fera EST contigs assigned as AOX in the Genomic Facilities databases (UCLA). The expression of the transcripts was studied on buds collected ¡n Maipo and Elqui Valley. Bes¡de that, chilling temperature effect and Sodium Azide treatment was studied on the express¡on of AOX transcripts in dormant buds. Results showed that express¡on of both AOX transcripts AOX23 and AOX53 were induced by different factors, while AOX23 was induced by chilling temperatures, AOX53 was induced by sodium azide treatments, a mitocondrial venom that inhibits the cytochrome ox¡dase (COX). ln mid-July both transcripts were expressed in buds of grapevines grown in the Maipo valley, while in the Elqui valley only one of the transcript was expressed. lnmunoblot analysis showed positive results only in buds that were exposed to chilling temperatures.