Diseño y evaluación de reacciones isotérmicas caseras para la detección de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici con miras a un futuro uso en terreno

Abstract

El tomate es uno de los cultivos de mayor importancia a nivel mundial, cuyo rendimiento se ve fuertemente afectado por enfermedades como la marchitez causada por el hongo Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici (Fol). Ante la falta de un método de control efectivo contra el patógeno, su detección temprana en suelo es vital para la agricultura. En este contexto, la amplificación isotermal mediada por loops (LAMP) se presenta como una herramienta relevante para una detección molecular de Fol que sea específica, rápida, fácil y con el potencial de ser aplicable en terreno sin la necesidad de un termociclador. En el presente Seminario de Título, se trabajó en el desarrollo de un método LAMP para detección de Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici (Fol). Se validó experimentalmente un set de partidores para la detección de Fol a partir de reacciones isotermales LAMP preparadas con reactivos caseros y enzimas expresadas de manera local. Para esto, se diseñó un control positivo de reacción en base a una región conservada del gen six5, un factor de virulencia conservado y específico para Fol, la cual fue clonada en un plásmido y transformada en bacterias competentes, desde las cuales obtener una dilución de ADN plasmidial útil como control positivo. Para la validación del control en reacciones isotermales se utilizó, en primera instancia, un conjunto de partidores previamente descrito en la literatura. Sin embargo, la repetida amplificación inespecífica de los controles negativos llevó al diseño y validación experimental de tres nuevos conjuntos de partidores mediante reacciones LAMP colorimétricas y un LAMP a tiempo real. Los resultados obtenidos permitieron validar al set tres como el mejor conjunto de partidores para la detección del gen six5 de Fol en reacciones isotermales preparadas con reactivos y enzimas locales. Junto con lo anterior, se comprobó que preparaciones de reacciones isotermales preparadas de manera local pueden ser liofilizadas y almacenadas hasta dos meses a temperatura ambiente de manera estable sin pérdida de actividad, lo que fue evaluado mediante reacciones LAMP GMO Detective que detectan la presencia transgénica del promotor 35S desde muestras de alimentos. Se debe considerar que, para la obtención de estos resultados, se utilizó una enzima sin glicerol como estabilizante y que tanto el buffer isotermal como el MgSO4 fueron añadidos en la etapa de rehidratación de la reacción. Este trabajo demuestra la estabilidad y robustez que presentan reacciones LAMP caseras en su formato liofilizado, una característica clave para un posible uso como herramienta diagnóstica de patógenos agroecológicos in situ. A corto plazo, se espera evaluar la detección específica de Fol desde muestras de campo, utilizando los partidores validados en este Seminario con los protocolos de preparación de LAMP liofilizado. Además, el uso de enzimas y reactivos de producción local en este trabajo busca inspirar a otros grupos a sumarse al desarrollo colaborativo de herramientas moleculares abiertas que permitan, a largo plazo, avanzar hacia un modelo de desarrollo sustentable basado en el libre conocimiento y la independencia tecnológica a escala local.

Tomato is one of the most important crops worldwide, whose yield is strongly affected by its susceptibility to diseases such as tomato wilt, caused by the fungus Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici (Fol). In the absence of an effective control method against this pathogen, its early detection in soil is vital for agriculture. In this context, loop-mediated isothermal amplification (LAMP) offers itself as a relevant tool for a Fol-specific molecular detection that is fast, easy to implement and has the potential to be applicable in the field without the need of a thermal cycler. In the present thesis, a LAMP method for the detection of Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici (Fol) was developed. A set of LAMP primers was experimentally validated for its use in Fol detection in isothermal LAMP reactions prepared with home-made reagents and locally expressed enzymes. To achieve this, a positive control reaction was designed, based on a conserved region of the six5 gene, a virulence factor specific for Fol, which was cloned into a plasmid and transformed into competent bacteria, from which to obtain a dilution of plasmid DNA that can be used as a positive control. To validate this DNA in isothermal LAMP reactions, a set of previously described primers was used at first. However, repeated unspecific amplification of the negative controls led to the design and experimental validation of three new sets of primers in colorimetric LAMP reactions and a real-time LAMP reaction. The results obtained here allowed the validation of set 3 as the best set of LAMP primers for the detection of the Fol six5 gene in isothermal reactions prepared with local reagents and enzymes. Also, it was proven that locally-prepared isothermal reaction mixes can be lyophilized and stored up to two months at room temperature in a stable manner without any loss of activity, which was evaluated in this case for LAMP GMO Detective reactions that detect the transgenic presence of the 35S promoter in food samples. It should be noted that, to obtain these results, a glycerol-free enzyme was used and that both isothermal buffer and MgSO4 were added in the rehydration stage of the reaction. This work demonstrates the stability and robustness of home-made LAMP reactions in their lyophilized format, a key feature for its future potential use as a diagnostic tool for in situ detection of agroecological pathogens. In the short term, Fol-specific detection from field samples should be evaluated using the primers validated in this study along with the freeze-dried LAMP preparation protocols. In addition, the use of locally-produced enzymes and reagents in this Seminar aims to inspire other groups to join the collaborative development of open molecular tools that will allow, in the long term, to advance towards a sustainable development model based on open knowledge and technological independence at a local scale.