Studying the role of BiP as a chaperone through single molecule force spectroscopy

Abstract

El control de calidad y la proteostasis son procesos cruciales en la célula para mantener la homeostasis, y las chaperonas tienen un rol clave en esto. BiP (Por sus siglas in inglés Immunoglobulin Binding Protein) es un miembro de la familia de chaperonas moleculares HSP70 localizada en el Retículo endoplásmico que participa en varios procesos, tales como el plegamiento de proteínas y la activación de la respuesta de proteínas desplegadas, UPR (por sus siglas en inglés Unfolded Protein Response). BiP se une a las proteínas y estabiliza su estado desplegado, luego se desune para darles la oportunidad de plegarse espontáneamente. Si las proteínas son incapaces de hacerlo BiP se une una vez más, evitando así el plegamiento erróneo y la agregación. El objetivo de este proyecto fue estudiar la función de BiP como chaperona. Se desconocía cómo BiP afectaba exactamente a las vías de plegamiento de las proteínas y no se había demostrado directamente a qué estado de plegamiento de la proteína de sustrato se une. Además, a nuestro conocimiento todos los estudios sobre la unión de BiP y afinidad se han hecho utilizando péptidos y no proteínas completas. Para este estudio se emplearon pinzas ópticas para experimentos de espectroscopía de fuerza de molécula única para investigar cómo BiP afecta al mecanismo de plegamiento de una proteína y cómo este efecto depende de los nucleótidos. Usando la proteína MJ0366 como sustrato de BiP, se realizaron ciclos de estiramiento y relajación a velocidad constante para desplegar y replegar el sustrato la proteína sustrato. En ausencia de BiP, MJ0366 se desplegó y se replegó en cada ciclo de tiraje. Sin embargo, cuando se añadió BiP, la frecuencia de los eventos de plegamiento de MJ0366 disminuyó significativamente. La pérdida de estos eventos siempre ocurrió después de un evento de despliegue exitoso. Este proceso fue dependiente de las concentraciones de ATP y ADP, cuando se disminuyó el ATP o se añadió ADP, aumentó la duración de los períodos sin eventos de plegamiento. El efecto observado se debió a la unión de BiP a MJ0366 y no a interacciones inespecíficas (BSA o lisozima, usados como control). Estos resultados muestran que la afinidad por la proteína sustrato aumentó en estas condiciones. Por lo tanto, concluimos que BiP se une al estado desplegado de MJ0366 evitando su replegamiento y que este efecto depende del tipo y concentración de nucleótidos. En resumen, la unión / liberación de la chaperona BiP tiene un efecto muy claro en el plegamiento de proteínas, después del despliegue mecánico de la proteína MJ0366 BiP es capaz de encontrar su sitio de unión, o sitios de unión (el número de sitios de unión no se ha demostrado experimentalmente en este trabajo), y unirse a ella de manera reversible, evitando la formación de contactos terciarios. Futuros estudios se llevarán a cabo con diferentes concentraciones de BiP para confirmar que sólo hay un sitio de unión para BiP en MJ0366 y así, empíricamente validar nuestro modelo y constantes de afinidad calculadas

Quality control and proteostasis are crucial processes in the cell to maintain homeostasis, and chaperones have a key role in this. BiP (Immunoglobulin Binding Protein) is an ER-located (Endoplasmic Reticulum) member of the family of HSP70 molecular chaperones that participates is various processes, such as protein folding and activation of the unfolded protein response. BiP binds to proteins and stabilizes their unfolded state, then unbinds to give them a chance to spontaneously fold. If proteins are unable to do so BiP binds once more, avoiding misfolding and aggregation. The aim of this project was to study the function of BiP as a chaperone. It was unknown how BiP exactly affected the protein folding pathway and it had not been directly demonstrated to which folding state of the substrate protein it binds. In addition, to our knowledge all studies regarding BiP binding and affinity have been done using peptides and not full proteins. For this, optical tweezers for single molecule force spectroscopy experiments were employed to investigate how BiP affects the folding mechanism of a protein and how this effect depends on nucleotides. Using the protein MJ0366 as BiP’s substrate, which most likely has just one binding site, pulling and relaxing cycles at constant velocity to unfold and refold the protein substrate were performed. In the absence of BiP, MJ0366 unfolded and refolded in every pulling cycle. However, when BiP was added the frequency of folding events of MJ0366 significantly decreased. The loss in folding always occurred after a successful unfolding event. This process was dependent on ATP and ADP concentrations, since when either ATP was decreased or ADP was added, the duration of periods without folding events increased. The observed effect was due to the binding of BiP to MJ0366 and not nonspecific interactions (BSA or lysozyme, used as controls). These results show that the affinity for the substrate protein increased in these conditions. Therefore, we conclude that BiP binds to the unfolded state of MJ0366 and prevents its refolding and that this effect depends on the type and concentration of nucleotides. In summary, BiP chaperone binding/release has a very clear effect in protein folding, after mechanical unfolding of the protein MJ0366 BiP is able to find its binding site, or sites (the number of binding sites has not been experimentally demonstrated in this work), and bind in a reversible manner, avoiding the formation of tertiary contacts. Future studies will be performed with different concentrations of BiP to confirm that there is only one binding site for BiP in MJ0366 and so, empirically validate our model and calculated affinity constants