Papel de la Policistina-1 en la regulación de BIN1 y la formación de la ultraestructura de los túbulos transversos en los cardiomiocitos

Abstract

La Insuficiencia cardíaca (IC) es la incapacidad del corazón de generar un adecuado gasto cardíaco de acuerdo a la demanda requerida por el organismo. Uno de los cambios estructurales que presenta el corazón durante la IC son las alteraciones en los túbulos transversos (túbulos-T). Los túbulos-T son invaginaciones de la membrana que desempeñan un papel fundamental en el acoplamiento excitación-contracción de los cardiomiocitos. La expresión de la proteína Bridging integrator 1 (BIN1) específicamente, las isoformas cardiacas BIN1+13 y BIN1+13+17 en cardiomiocitos promueve la formación y la ultraestructura de los túbulos-T además de la mantención de los canales de calcio sensibles a potencial tipo-L (LTCC) en los mismos. También, ha sido descrito que el factor transcripcional c-Myc es un regulador negativo de la expresión de BIN1 y además se encuentra sobre expresado en la insuficiencia cardíaca. La Policistina-1 (PC1) es un mecanosensor, se expresa de forma ubicua y la expresión deficiente en los cardiomiocitos de ratones knockout (KO) reduce la función cardíaca. Sin embargo, actualmente se desconoce si la PC1 regula la formación de túbulos-T inducida por BIN1 a través de un mecanismo regulado por c-Myc. Para evaluar si la PC1 regula la expresión de BIN1 y la formación de los túbulos-T en los cardiomiocitos, utilizamos ratones adultos C57BL/6 silenciados selectivamente en cardiomiocitos para PC1 (PC1 KO) de 9 a 11 semanas y de 7 a 9 meses de edad , así como cardiomiocitos ventriculares neonatas aislados de ratas Sprague-Dawley silenciados para PC-1 (NRVMs siPC1). Silenciamos PC1 y c-Myc usando siRNA específicos. Además, sobre expresamos por medio de adenovirus, el C-terminal de PC1 (Ad-FLM). La función cardíaca en los ratones PC1 KO fue determinada por ecocardiografía, evaluamos la sobrevida en estos animales, así como también los parámetros morformétricos (peso del corazón, pulmón y longitud de la tibia). El contenido de proteína y el ARNm de BIN1, PC1 y c-Myc, se evaluó usando western blot y qRT-PCR, respectivamente. La ultraestructura de los túbulos-T en el tejido cardíaco ventricular fue evaluada mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Encontramos que la expresión deficiente de PC1 en tejido cardiaco ventricular de ratones PC1 KO de 9 a 11 semanas de vida genera disfunción cardíaca (reducción el la fracción de eyección y de acortamiento), y en los PC1 KO de 7 a 9 meses de edad esta disfunción progresa hacia una cardiomiopatía dilatada, lo cual disminuye su sobrevida. Esto hallazgos se asociaron con niveles reducidos de contenido proteico y del ARNm de BIN1 total, tanto a las 9-11 semanas como a los 7-9 meses de edad. Aunque en los NRVMs siPC1 no hubo diferencias en los niveles proteicos ni en el ARNm de BIN1 comparado con sus controles. De manera interesante, encontramos que en los ratones PC1 KO de 9 a 11 semanas y los NRVMs siPC1, la isoforma cardíaca BIN1+13 disminuye y la BIN1+13+17 aumenta significativamente. Mientras en los PC1 KO de 7 a 9 meses el ARNm de todas isoformas

cardíacas de BIN1 se encuentran disminuidas. Además, cuando se sobre expresó el C- terminal de PC1 (Ad-FLM) en los NRVMs observamos aumento del ARNm de BIN1+13 y

una disminución significativa de BIN1+13+17. Por otra parte, encontramos niveles aumentados del contenido proteico y del ARNm de c-Myc en el tejido cardíaco de ratones PC1 KO en ambas edades y en NRVMS siPC1. Mientras que en los NRVMs Ad-FLM el

contenido de proteína y de ARNm de c-Myc estaba disminuido. Asimismo, en NRVMs si- c-Myc, encontramos un aumento del contenido proteico y del ARNm del BIN1 total, un

aumento significativo para la isoforma BIN1+13 y una disminución de BIN1+13+17. En cambio en los NRVMs en los que se sobre expresó c-Myc (Ad c-myc), encontramos disminución en el contenido de proteína de BIN1 total , del ARNm de BIN1t y del ARNm de la isoforma BIN1+13. Finalmente, encontramos cambios en la ultraestructura de los túbulos-T (aumento del área del lumen y disminución de la electrondensidad) en el tejido cardíaco ventricular de los ratones PC1 KO en ambas edades, pero sólo los de 7 a 9 meses de edad, presentan diminución del número de túbulos-T por área. Estos datos en conjunto sugieren que la PC1 puede ser un regulador de la expresión diferencial de las isoformas cardiacas de BIN1 en los cardiomiocitos, a través de un mecanismo de regulación negativa de c-Myc y que su ausencia genera cambios estructurales en los túbulos-T.

Heart failure (HF) is the inability of the heart to generate adequate cardiac output according to the demand required by the body. One of the structural changes that the heart presents during HF are alterations in the transverse tubules (T-tubules). T-tubules are membrane invaginations that play a fundamental role in the excitation-contraction coupling of cardiomyocytes. The expression of the protein Bridging integrator 1 (BIN1) specifically, the cardiac isoforms BIN1+13 and BIN1+13+17 in cardiomyocytes promotes the formation and ultrastructure of T-tubules. In addition to the maintenance of potential-sensitive calcium channels. type-L (LTCC) in them. Also, it has been described that the transcriptional factor c-Myc is a negative regulator of BIN1 expression and is also overexpressed in heart failure. Polycystin-1 (PC1) is a mechanosensor, it is ubiquitously expressed, and its deficient expression in cardiomyocytes of knockout (KO) mice reduces cardiac function. However, it

is currently unknown whether PC1 regulates BIN1-induced T-tubule formation through a c- Myc-regulated mechanism. To assess whether PC1 regulates BIN1 expression and T- tubule formation in cardiomyocytes, we used adult C57BL/6 mice selectively silenced in

cardiomyocytes for PC1 (PC1 KO) at 9 to 11 weeks and 7 to 9 months of age. As well as

neonatal rat ventricular cardiomyocytes isolated from Sprague-Dawley rats silenced for PC- 1 (NRVMs siPC1). We silenced PC1 and c-Myc using specific siRNAs. In addition, we

overexpress by means of adenoviruses, the C-terminus of PC1 (Ad-FLM). Cardiac function in PC1 KO mice was determined by echocardiography, we evaluated survival in these animals, as well as morphometric parameters (heart weight, lung weight, and tibial length). The protein and mRNA content of BIN1, PC1 and c-Myc, was evaluated using western blot and qRT-PCR, respectively. The ultrastructure of T-tubules in ventricular cardiac tissue was evaluated by transmission electron microscopy (TEM). We found that deficient expression of PC1 in ventricular cardiac tissue of 9 to 11-week-old PC1 KO mice generates cardiac dysfunction (reduced ejection fraction and shortening), and in 7 to 9-month-old PC1 KO mice this dysfunction progresses to dilated cardiomyopathy, which decreases their survival. These findings were associated with reduced levels of protein content and total BIN1 mRNA at both 9-11 weeks and 7-9 months of age. Although in siPC1 NRVMs there were no differences in protein levels or BIN1 mRNA compared to their controls. Interestingly, we found that in 9 to 11-week-old PC1 KO mice and siPC1 NRVMs, the cardiac isoform BIN1+13 is significantly decreased and BIN1+13+17 is significantly increased. While in PC1 KO from 7 to 9 months the mRNA of all cardiac isoforms of BIN1 are decreased. In addition, when the C-terminal of PC1 (Ad-FLM) was overexpressed in the NRVMs, we observed an increase in the mRNA of BIN1+13 and a significant decrease in BIN1+13+17. On the other hand, we found increased levels of c-Myc mRNA and protein content in heart tissue of PC1 KO mice at both ages and in NRVMS siPC1. While in the Ad-FLM NRVMs the protein and mRNA content of c-Myc was decreased. Likewise, in NRVMs si-c-Myc, we found an increase in the protein and mRNA content of total BIN1, a significant increase for the

BIN1+13 isoform, and a decrease in BIN1+13+17. In contrast, in the NRVMs in which c- Myc (Ad c-myc) was overexpressed, we found a decrease in the protein content of total

BIN1, of BIN1t mRNA, and of the BIN1+13 isoform mRNA. Finally, we found changes in the ultrastructure of the T-tubules (increased lumen area and decreased electron density) in the ventricular heart tissue of PC1 KO mice at both ages, but only those aged 7 to 9 months showed decreased number of T-tubules per area. Together, these data suggest that PC1 may be a regulator of the differential expression of cardiac isoforms of BIN1 in cardiomyocytes, through a negative regulation mechanism of c-Myc, and that its absence generates structural changes in T-tubules.