Nanopartículas de oro conjugadas a péptidos para el desarrollo de una nueva estrategia terapéutica para la enfermedad de Alzheimer

Abstract

Varias son las patologías por el mal plegamientos y la posterior agregación de proteínas, produciendo especies tóxicas. En la actualidad no existe un tratamiento efectivo para combatir este tipo de enfermedades, por lo que en nuestro laboratorio se está desarrollando una novedosa estrategia terapéutica que se basa en el uso de nanotecnología. Es posible conjugar nanopartículas de oro (AuNP) a diversos péptidos que poseen afinidad por estos agregados tóxicos y dirigirlos específicamente donde estos se encuentren, así se podría realizar una especia de “cirugía molecular”, basadas en la excitación de estas AuNP por parte de un Campo magnético oscilante, lo cual produce la liberación de energía por parte de estas nanopartículas permitiendo la desagregación de estos complejos proteicos, convirtiéndolos en especies menos tóxicas. En el caso específico de la presente tesis, esta se enfoca en una etapa inicial del proyecto, donde se pretende determinar la estabilidad de distintos conjugados AuNP-compuestos y la capacidad que presentan para unirse selectivamente a los agregados tóxicos de la proteína β-amiloide (Aβ) involucrada en la enfermedad de Alzheimer tanto in vitro como ex vivo. Como primer apronte a los estudios in vivo se determinó la toxicidad y biodistribución de distintas dosis de nanopartículas de oro de ratones silvestres. Además, se determinó el paso de uno de estos conjugados a través de la BHE. Por lo tanto, se sintetizaron AuNP de 10 nm de diámetro mediante la reducción de ácido tetracloroáurico (HAuC14) con citrato de sodio dihidratado y se conjugaron al péptido CLPFFDNH2(lnh), el cual es una modificación del péptido disruptor de laminas β LPFFDNH2que posee afinidad por los agregados de Aβ. También fueron utilizados 2 péptidos, para evaluar si esta interacción se secuencia dependiente. Uno de estos presenta una secuencia elegida al azar (CARTG) lo cual no presenta ningún tipo de relación con el péptico Aβ, por lo que presenta una gran afinidad por las fibras amiloides. Otros dos conjugados fueron sintetizados, uno está compuesto por la nanopartícula más moléculas de tioflavina T, la cual tiene la habilidad de interactuar con gran variedad de agregados. El otro conjugado esta compuesto por la nanopartícula y la región Fab del anticuerpo 6E10 que reconoce al péptido Aβ. De los cinco conjugados en estudio, solo cuatro mostraron afinidad por las fibras amiloides tanto in vitro como ex vivo, y solo el conjugado con el péptido CARTG no presentó ningún tipo de interacción, con lo cual demuestra que esta interacción debe ser especifica. En relación a los estudios de toxicidad, biodistribución y paso a través de la BHE, estos se realizaron a partir de la inyección intraperitoneales de tres dosis distintas de nanopartículas durante 8 días en ratones. En todos los casos no se observó ningún grado de toxicidad. En relación a la biodistribución se observó una mayor acumulación de nanopartículas en el hígado, riñón, baso y en menor medida en el cerebro, sin embrago lo suficiente para concluir que estas nanopartículas son capaces de cruzar la BHE.

Several pathologies produced by the misfolding and later aggregation of proteins, producing toxic species. Presently an effective treatmsnt does not exist to treat these diseases. In our laboratory we are developing a novel therapeutic stratogy, based on tho use of nanotechnologr. Gold nanoparticles (AuNP) coated with peptides with high affinity for toxic protein deposits that triggers these diseases, and could be targeted specifically to these aggegates and give rise to a local "molecular surgery", based on the excitation ofthese AuNPs produced by a magnetic oscillating fietd. when these nanoparticles are excitd they release Ánough enerry that allows the disaggregafion of t1rcse protein complexes, tuming them into less toxic species. Thus, this thesis is framed as the first stage and is being pursue to obtain stable Atfi.li-compound conjugates able to sele€tively attach to the toxic deposits of the amyloid β protein (Aβ) involved in Aláeimer's disease. As a frst approach to the iz vivo studies we determinate the toxici§, biodistribution ofthese nanoparticles. Also we determinate the ability of one ofthe conjugates to cross the Blood Brain Barrier (BBB)' Therefore, AuNPs of 10 nm of diameter were synthesized by means ofthe reduction ofacid tetracluoroauric (HAuCl4) with citrate of sodium dehydrated. They were conjugated to the peptide CLPFFDNH2 (Inh), whieh is a modification of the β-sheet breaker LPFFDNH2 ih"t po".".to atEni§ for the Aβ aggegates. Also we used 2 peptides to evaluate ifthis iúeráction is a sequence dependerú. One ofthese peptides has random sequences (CARTG) that does not have any affinity for Aβ. The other peptide is a fragrnent of20 amino acids that corresponded to the region 15-34 of Aβ, so it has a great affinity for the amyloid fibrils. Also wó synthesized to oflrcr conjugates. One is based on the interaction betweon the gold nanoparticle and thioflavine T, which is a molecule that has great afflfrity for all kind o}aggregaies. The other conjugate is based on the interaction between the gold nanoparticle and the Fab region ofthe 6810 antibody that recognize the Aβ peptide. From the five conjugated in study only four presented affrnity for the Aβ fibrils in vitro and ex vivo. Only the conjugated with the CARTG peptide didn't show any affinity for the fibrils. This result dernonstrated that this interaction must be specific. ln relation to the studies of toxicity, biodistribution and permeability of the BBB' these were carried out by means of tho injection oftlree differenl doses ofnanoparticles in mice during eighi days. In all cases wo did not see any toxicity. In relation with the bioüitribution analysis it was possible to see a higher accumulation ofnanoparticles in the liver, kidney, spleen ard in a lower amount in the brairi' Nevertheless, it is sufEcient to conclude that these nanopartícles are capable of crossing the BBB.