Identificación y análisis estructural y funcional de los promotores de los genes carotenogénicos psy2 y lcyb1 de daucus carota

Abstract

Los carotenoides son compuestos lipídicos isoprenoides coloreados sintetizados por todos los organismos fotosintéticos y también por algunas bacterias y hongos. Estos son esenciales en la fisiología vegetal, principalmente por sus funciones durante la fotosíntesis, la fotoprotección y la síntesis de hormonas. En animales, también son indispensables debido a su actividad antioxidante y por ser precursores de la vitamina A. La ruta de síntesis de estos compuestos se encuentra bien caracterizada y se han identificado las enzimas esenciales que participan en ella. Sin embargo, la regulación de esta ruta en plantas no se comprende aún a cabalidad. Actualmente, se sabe que el principal mecanismo regulatorio ocurre a nivel transcripcional, donde factores activadores como la luz y el desarrollo tienen un efecto directo en la activación de la expresión de los genes carotenogénicos, como el gen psy, uno de los más importantes puntos de regulación en la ruta. Daucus carota (zanahoria) es una hortaliza que acumula elevados niveles de carotenoides, principalmente B-caroteno, durante el desarrollo de su raíz modificada en oscuridad. En este órgano, la regulación de la ruta carotenogénica ocurriría en parte a nivel transcripcional, siendo el gen lcyb1 el que aumenta mayormente su expresión durante el desarrollo. Por otra parte, de los genes parálogos psy1 y psy2 presentes en esta planta, el gen psy2 estaría asociado mayormente a la carotenogenesis en la raíz y en etapas tempranas del desarrollo de las hojas. Considerando las evidencias de regulación a nivel transcripcional de esta ruta en zanahoria, durante este trabajo se identificó y evaluó los promotores de los genes

psy2 y lcyb1. Se logró identificar y clonar regiones regulatorias de 769 pb para el promotor de psy2 y de 1.057 pb del promotor de lcyb1. Ambas regiones presentaron numerosos motivos regulatorios de respuesta a luz, así como otros de respuesta a estrés abiótico y fitohormonas (principalmente ABA, auxinas y giberelinas). Los promotores obtenidos fueron divididos en dos fragmentos (promotor parcial y promotor mínimo) y fusionados al gen reportero GFP con el fin de caracterizar su funcionalidad en la planta modelo N tabacum. En plantas de tabaco transgénicas, el promotor parcial de /cyb1 presentó una actividad mucho mayor (más de 20 veces) que la del promotor mínimo de este gen, mientras que el promotor parcial de psy2 presentó una actividad basal levemente mayor que el mínimo. Determinamos que en plántulas de zanahoria silvestre, el gen psy2 se indujo en presencia de ABA y se reprimió en presencia de la auxina 2,4-D, mientras que el gen lcyb1 se indujo levemente en presencia de ABA y GA3. Considerando estos resultados, se evaluó el efecto de estas hormonas en las plantas de tabaco transgénicas que expresan GFP bajo el promotor de psy2 y lcyb. Se concluyó que el promotor parcial de psy2 se indujo por ABA y que el promotor mínimo de psy2 se reprimió levemente en el tratamiento con ABA y la auxina 2,4-D. Esto se correlacionaría con los elementos regulatorios identificados en el promotor de psy2 e indica que en plántulas de zanahoria, tanto la inducción del gen psy2 mediada por ABA como su represión por 2,4-D, se deberían a una regulación de sus promotores en respuesta a estas hormonas. Además, se determinó que en las plantas de tabaco transgénicas, el promotor parcial de lcyb1 fue inducido por ABA, en correlación con los elementos de respuesta a

esta hormona presentes en su promotor y con la inducción de este gen en respuesta a ABA. Por otra parte, los promotores parcial y mín¡mo de lcybl Íuercn reprimidos por GA3 en las plantas de tabaco transgénicas, a diferencia de lo obtenido en zanahorias silvestres tratadas con esta hormona. Por último, ambos promotores, al ¡gual que el promotor parcial de psy2, fueron inducidos por luz. Esto último se correlaciona con los elementos de respuesta a este estimulo presentes en ellos.