Efecto del quitosano en la acción parasitaria de cepas nativas de hongos nematófagos endófitos frente al nematodo cebo Steinernema australe

Abstract

El tomate (Solanum lycopersicum) es de gran relevancia a nivel global, debido a su aporte nutricional y ser buena fuente de antioxidantes. Es una de las hortalizas más cultivadas en Chile y en el mundo. No obstante, sus cultivos son susceptibles a diversas enfermedades causadas por agentes fitopatógenos. Dentro de éstos, los nematodos fitopatógenos (NFs) son uno de los patógenos más frecuentes y nocivos para este tipo de cultivos, provocando grandes pérdidas económicas a nivel internacional. Existen diferentes métodos de control para este tipo de patógenos, siendo el control químico el más utilizado y efectivo en el corto plazo; sin embargo, su uso excesivo produce un efecto negativo para el medioambiente, la salud de las personas y la sostenibilidad de los sistemas productivos. En este contexto, el uso de depredadores naturales de NFs, como los hongos nematófagos (HNs), surge como alternativa sostenible. En la naturaleza, muchos de estos HNs actúan como endófitos, colonizando la planta hospedera y otorgándole beneficios como la estimulación del crecimiento y protección frente a patógenos, entre otros. Sin embargo, la efectividad de los formulados usados en terreno suele disminuir con el tiempo. Por otro lado, existen compuestos biodegradables y de baja toxicidad como el quitosano, un polímero derivado del procesamiento de deshechos de la industria pesquera (Ej. caparazón de crustáceos), que puede aumentar el parasitismo de los HNs frente a NFs. En el Laboratorio de Bioprocesos de Instituto de Investigaciones Agropecuarias (INIA) Centro Regional Quilamapu, se han aislado distintas cepas nativas de HNs con potencial endófito, algunas de ellas masificadas para la formulación de productos comerciales de uso agrícola. De esta manera, el objetivo de esta investigación fue identificar a nivel de especie cinco cepas nematófagas de los géneros Beauveria, Metarhizium, Paecilomyces, Metapochonia y Trichoderma (una de cada género), determinar la colonización endófita de estos hongos en tomate y evaluar el efecto del quitosano en el crecimiento fúngico y en la actividad parasitaria de las cepas contra “nematodos cebo”. Para este fin, se identificaron a nivel de especie mediante un análisis de secuencia multi-locus (MLSA), seguido de un ensayo de colonización endófita en tomate y observando su crecimiento fúngico en presencia de quitosano in vitro. Se realizó un ensayo de parasitismo in vitro frente al nematodo cebo Steinernema australe en presencia de tres concentraciones distintas de quitosano (7,5 x 102 ppm; 1,5 x 103 ppm y 2,25 x 103 ppm). Los resultados obtenidos indicaron que las cepas nematófagas estudiadas pertenecen a las especies Beauveria peruviensis, Metarhizium brunneum, Paecilomyces carneus y Metapochonia rubescens. La cepa de Trichoderma no pudo ser identificada a nivel de especie, por lo que se requiere del análisis de más regiones marcadoras para afirmalo con certeza. P. carneus, M. rubescens, Trichoderma sp. presentaron capacidad de colonización endófitica en tomate, en contraste B. peruviensis y M. brunneum no presentaron colonización endofítica. En cuanto al crecimiento en quitosano, todas las especies mostraron tolerancia a las distintas concentraciones de quitosano aplicadas tras 15 días de incubación. De las cepas analizadas, B. peruviensis y Trichoderma sp. presentaron un aumento actividad nematófaga, la que se incrementó en presencia de 1,5 x 103 ppm y 2,25 x 103 ppm de quitosano en el caso de Beauveria y 2,25 x 103 ppm en Trichoderma sp., en comparación a los tratamientos en ausencia de este polímero. Estos resultados mostraron que todas las cepas estudiadas son tolerantes a distintas concentraciones de quitosano y que éste incrementa la actividad parasitaria de B. peruviensis y Trichoderma sp. La presente Memoria de Título es el primer reporte sobre el efecto del quitosano en el parasitismo de hongos nematófagos endófitos nativos sobre el nematodo cebo S. australe, sobre la capacidad de colonización endofítica de las especies P. carneus y M. rubescens, y sobre la capacidad nematófaga de B. peruviensis

The tomato (Solanum lycopersicum) is of great relevance globally, due to its nutritional value and being a good source of antioxidants. It is one of the most cultivated vegetables in Chile and the world. However, its crops are susceptible to various diseases caused by phytopathogenic agents. Among these, plant-parasitic nematodes are one of the most frequent and harmful pathogens for this crop, causing great economic losses at the international level. There are different control methods for this type of pathogens, being chemical control the most used and effective in the short term, however, its excessive use leads to a negative effect on the environment, people's health, and the sustainability of production systems. In this context, the use of natural predators of plant-parasitic nematodes, such as nematophagous fungi, emerges as a sustainable alternative. In nature, many of these nematophagous fungi act as endophytes, colonizing the host plant and providing benefits such as growth stimulation, protection against pathogens, among others. However, the effectiveness of field formulations tends to diminish over time. On the other hand, there are biodegradable and low toxicity compounds such as chitosan, a polymer derived from the processing wastes from the fishing industry (e.g. crustacean shells), which can increase the parasitism of nematophagous fungi against plant-parasitic nematodes. In the Bioprocess Laboratory of Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIA) Quilamapu Regional Center, different native nematophagous strains of fungi with endophytic potential have been isolated, some of them massified for the formulation of commercial products for agricultural use. Thus, the objective of this research was to identify at the species level five strains of the genera Beauveria, Metarhizium, Paecilomyces, Metapochonia and Trichoderma (one of each genus) previously isolated as nematophagous, the endophytic colonization of the fungi on tomato, and the effect of chitosan on fungic growth and parasitic activity of the strains. For this purpose, they were identified to species level by multi-locus sequence analysis (MLSA), followed by an endophytic colonization assay on tomato and by observing their fungic growth in the presence of chitosan in vitro. An in vitro parasitism assay was performed against the "bait nematode" Steinernema australe in the presence of three different concentrations of chitosan (7.5 x 102 ppm; 1.5 x 103 ppm and 2.25 x 103 ppm). The results obtained indicated that these belong to the species Beauveria peruviensis, Metarhizium brunneum, Paecilomyces carneus and Metapochonia rubescens. The Trichoderma strain could not be identified to species level, so further analysis of marker regions is required to state it with certainty. Paecilomyces carneus, M. rubescens, Trichoderma sp. presented endophytic colonization capacity in tomato, in contrast B. peruviensis and M. brunneum did not present endophytic colonization. Regarding growth in chitosan, all species showed tolerance to the different concentrations of chitosan applied during 15 incubation days. Of the strains tested, B. peruviensis and Trichoderma sp. showed an augmentation in the nematophagous activity, which increased in the presence of 1.5 x 103 ppm and 2.25 x 103 ppm of chitosan in the case of the former and 2.25 x 103 ppm in the latter, compared to treatments in the absence of this polymer. These results showed that all the strains studied are tolerant to different concentrations of chitosan and that chitosan increases the parasitic activity of B. peruviensis and Trichoderma sp. The present thesis is the first report on the effect of chitosan on the parasitism of native nematophagous endophytic fungi on the bait nematode S. australe, on the endophytic colonization capacity of P. carneus and M. rubescens species, and on the nematophagous capacity of B. peruviensis