Análisis de actividad antimicrobiana y presencia de elementos genéticos de tipo dsRNA en levaduras antárticas

Abstract

El continente antártico es el hábitat de una gran variedad de microorganismos, entre los cuales se incluyen las levaduras. Debido a las condiciones extremas de este ecosistema, los microorganismos están sometidos a una fuerte competencia para obtener acceso a los recursos del medio, por lo que las levaduras han desarrollado estrategias que le confieren una ventaja con respecto a sus competidores. Una de las estrategias desarrolladas por estos microorganismos es la producción de proteínas antimicrobianas capaces de matar a bacterias o a otras levaduras. Este fenómeno ha sido ampliamente reportado en levaduras mesófilas pero sabemos muy poco sobre esta actividad en levaduras de origen antártico y de ambientes fríos en general. La actividad antimicótica de levaduras, conocida como actividad killer, fue descubierta en el año 1963 en una cepa de Saccharomyces cerevisiae la cual era capaz de secretar proteínas con la capacidad de matar a células sensibles de igual o relacionado género sin un contacto directo célula-célula. Este fenómeno es muy frecuente en levaduras y representa un mecanismo de competición por interferencia. Las bases genéticas de este fenotipo son variables y la toxina puede estar codificada por genes nucleares como también por elementos genéticos extracromosómicos. Todas las toxinas killer descritas son producidas óptimamente durante la fase de crecimiento exponencial y en general tienen un perfil de actividad a pH bajo. Durante las últimas décadas, las levaduras killer han sido de utilidad en diferentes áreas, entre las cuales destacan la industria fermentativa para la producción de pan, vino y cerveza, y en medicina, para el tratamiento de infecciones causadas por hongos en animales y humanos. En trabajos previos, se analizó la existencia del fenotipo killer en 24 especies de levaduras antárticas, determinando que sólo nueve de ellas presentan este fenotipo, entre las cuales destacaron las levaduras Wickerhamomyces anomalus y Candida parapsilosis por su gran espectro de acción y por la generación de halos de muerte de gran tamaño, con respecto a la actividad presentada por el resto de las levaduras. En el presente trabajo, se analizó la capacidad de las levaduras antárticas para matar a algunas bacterias y levaduras de importancia médica, determinando que sólo la levadura C. parapsilosis presenta actividad antimicrobiana contra la bacteria Klebsiella geyteca. Además, se analizó la actividad de las muestras de extractos proteicos de las levaduras W. anomalus y C. parapsilosis, determinando que estas son mayormente activas en un rango de pH bajo, de entre 4,6 y 5,0, y que toleran concentraciones de sal de hasta un 0,1%, ya que concentraciones superiores a esto resultan inhibitorias. También se determinó que ambas muestras de extractos proteicos toleran un tratamiento térmico de 100°C por 1 h y mediante técnicas de purificación de proteínas se encontró que la actividad se relacionaa una sola proteína de 53 kDa para la muestra proveniente de W. anomalus y de 46 kDa para la muestra proveniente de C. parapsilosis. En paralelo a esto, se analizó la existencia de moléculas del tipo dsRNA en una colección de 41 cepas antárticas y mediante caracterización enzimática con nucleasa S1, DNasa 1 y RNasa A, se identificó la presencia de este tipo de moléculas en siete cepas de levaduras. Las moléculas fueron analizadas mediante análisis bioinformático a partir de sus secuencias determinando la identidad de algunas de ellas.

The Antarctic continent is the habitat of a wide variety of microorganisms, such as the yeasts. Due to the extreme conditions in this ecosystem, microorganisms are subjected to a strong competence to have access to the environmental resources, for which the yeasts have developed strategies to have an advantage against competitors. The main strategy is the production of antimicrobial proteins which can kill bacteria or yeast. This phenomenon has been widely reported in mesophilic yeasts but very little is known about this activity in yeast from Antarctica and from other cold environments. The killer activity was discovered in 1963 in a Saccharomyces cerevisiae strain that was able to secrete toxic proteins, that killed sensitive cells of the same or related genus without direct cell to cell contact. This phenomenon is very frequent among yeasts and represents a mechanism of interference competition. The genetic basis for this phenomenon is variable and the toxin can be encoded by nuclear genes or by extrachromosomal genetic elements. All described toxins are produced during exponential phase of growth and in general they are more active at low pH values. In the last decades, killer yeasts have been useful in fermentation industries during the production of bread, wine and beer, and in medicine, in the treatment of human and animal fungal infection. In previous studies, 24 Antarctic yeasts were analyzed to determine the existence of killer phenotype, found that nine yeast strains showed killer activity, among which Wickerhamomyces anomalus and Candida parapsilosis showed the best activity. In the current work, it was analyzed the capacity of Antarctic yeasts to kill some medically important bacteria and yeasts, finding that C. parapsilosis have antimicrobial activity against Klebsiella geyteca. Furthermore, the activity of extracellular protein samples of W. anomalus and C. parapsilosis was analyzed, finding that they have higher activity at low pH value and tolerate until 0,1% salt concentration. Also it was determined that the samples resist a heat treatment at 100°C for 1 h and by protein purification methods it was found that the activity would related to a single protein of 53 and 41 kDa for the samples from W. anomalus and C. parapsilosis, respectively. Furthermore, it was analyzed the existence of dsRNA molecules in 41 Antarctic yeast strains by enzymatic characterization with S1 nuclease, DNase I and RNase A. It was identified the presence of dsRNAs molecules in seven yeast strains. These molecules were partially cloned and sequenced, and by bioinformatic analysis it was suggested that these molecules correspond to totiviruses.